探针引物设计原则
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TaqMan® MGB探针设计原则
1.探针5' 端的第一个碱基不能是G。
2.用Primer Express®软件计算出来的探针Tm值应当在65-67°C 之间。
3.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基。
4.避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个及以上。
5.尽量使含C多于含G的探针。
如果C少于G，则使用互补链上的探针。
6.如果是SNP，多态位点尽量位于探针中央。
7.基因表达、cDNA定量研究中，特别设计探针跨过两个外显子，以增强扩增特异性
引物的设计原则
1.在探针确定以后再选择引物。
2.引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。
3.保持G-C含量在30-80%之间。
4.避免同一碱基重复过多。
特别是G，不可超过4个及以上。
5.用Primer Express®软件计算出来的Tm值应当在58-60°C之间。
6.在3’端的5个碱基中，G和C碱基的加起来不要超过2个。
7.扩增片段的长度在50-150 bp间。