第36讲 基因工程(包括PCR技术)-【2023大一轮】备战2023年高考生物一轮复习精讲课件

2.基因表达载体的构建——核心
(1)目的：使目的基因在_受__体__细__胞___中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同 时使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)组成
(3)构建过程
同种
3.将目的基因导入受体细胞 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达 的过程。
细胞类 型
方法
反转录 载体
DNA片段
(2)人工合成目的基因 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过__D__N_A__合__成__仪___用化学方法直 接人工合成。 ①化学合成法
氨基酸
脱氧 核苷酸
②反转录法
DNA
(3)利用PCR技术扩增目的基因
DNA DNA
大量
提醒 ①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)， 既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 ②引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链 的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
1） 经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被S__au_3_A__Ⅰ_____酶切后 的产物连接，理由是两__种__酶__切__割__后__产__生__的__片__段__具__有__相__同__的__黏__性__末__端_____。
图（c）
2） 若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因 的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基 因产物的有___甲__和__丙__，不能表达的原因是甲__中__目__的__基__因__插__在__启__动__子__的__上__游__，__丙_ _______中__目__的__基__因__插__在__终__止__子__的__下__游__，__二__者__的__目__的__基__因__均__不__能__被__转__录。
[解析] 由题意可知，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉 素抗性基因，所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨 苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄 青霉素抗性基因，所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均 能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但前者可以在含有四环素的培养基上生长 而后者不能，所以可用含有四环素的培养基，筛选出含有插入了目的基因的重组 质粒的大肠杆菌菌落。
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链
RNA聚合酶
磷酸二酯 核糖核苷 以单链DNA为模板,将单个核糖核苷酸依次连接
键
酸 到单链末端
2.基因工程的理论基础
3.载体上标记基因的作用 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有 抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因 在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系 中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
1.DNA相关酶的比较
名称 作用部位 作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯 键
DNA
将DNA切成两个或多个片段
DNA连接酶
磷酸二酯 键
DNA片 段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯 脱氧核苷 以单链DNA为模板,将单个脱氧核苷酸依次连接
键
酸 到单链末端
DNA（水解） 磷酸二酯
酶
键
DNA
第36讲 基因工程（包括PCR技术）
考点一 基因工程的操作工具 考点二 基因工程的基本操作程序 考点三 基因工程的应用和蛋白质工程 考点四 DNA粗提取与鉴定 真题再现
考点一 基因工程的操作工具
1. DNA连接酶的作用都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个
核苷酸之间的氢键。( × ) 2. E·coli DNA连接酶既能连接平末端，又能连接黏性末端。
续表
细胞类 方法 型
过程
受体细胞 特点
Ca2+处 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载 早期常用 简便、经济、
体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收
理法
原核细胞 有效
DNA分子
1）受体细胞为植物细胞时，受体细胞可以是体细胞和受精卵， 因为植物体细胞有全能性。 2）原核生物常作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质 相对较少。 3）受体细胞为动物细胞时，受体细胞是受精卵，因为高度分化的动物 体细胞的全能性受到限制。 4）Ca2+处理法中，Ca2+可以增加微生物细胞壁的通透性。
考向一 限制性核酸内切酶、DNA连接酶等酶的作用
1. 图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限 制酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、 Sau3AⅠ的切点是唯一的）。
图（a） 根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
图（b）
√ 6. 在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进 行过人工改造的。( √ )
1.基因工程的概念
类型 产品
生物 生物
人们的愿望
转基因
性状
遗传
2.基因工程的基本工具 (1)限制性核酸内切酶
限制酶是一类酶，而不是一种酶

序列
序列
提醒
核苷酸
①将一个基因从DNA分子上
磷酸二酯键
7. 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的D NA上。( √ ) 8. 有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的 功能活性是否与天然产品相同，属于个体生物学水平的鉴定。
(√)
一、基本操作程序
主要包括四个步骤：目的基因的获取、__基__因__表__达__载__体__的__构__建___、将目的基因导入 受体细胞、__目__的__基__因__的__检__测__与__鉴__定___。
1） 质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有__能__自__我___复__制__、__具___有__标__记___基__因 （答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和 终止子。 [解析] 质粒作为载体应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、含有一 至多个限制酶切割位点等。 2） 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在题述四种大肠杆菌细胞中，未 被转化的和仅含环状目的基因的细菌是不能区分的，其原因是__二__者__均__不__含__氨__苄__青_ _霉__素__抗__性__基__因__，__在__该__培__养__基__上__均__不__生__长____；并且__含__有__质__粒__载__体___和__含__有__插__入__了_ _目__的__基__因__的__重__组__质__粒__（__或__含__有__重__组__质__粒__）___的细菌也是不能区分的，其原因是__二_ _者__均__含__有__氨__苄__青__霉__素__抗__性__基__因__，__在__该__培__养__基__上__均__能__生__长____。在上述筛选的基础上， 若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__四__环_ _素___的固体培养基。
过程
受体细胞 特点
农杆菌 转化法
将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→导 入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细 胞的染色体DNA上→表达
体细胞或
经济、有效， 适用于双子 叶植物和裸 子植物
基因枪 法
目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒 子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组 织中→目的基因表达
受精卵
(×)
3. 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能
力的小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。( √ ) 4. 质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素合成基因、氨苄青霉素合成基因
等标记基因。(
)
×
5. 携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到 染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。( )
1.目的基因的获取
1）目的基因:主要指__编__码__蛋__白__质___的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。 2）获取方法方法 基因获取 PCR技术扩增人工合成
前提 从自然界已有的物种中分离 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物 基因比较小，核苷酸序列叶植 物中常用的 转化方法
续表
细胞类 方法 型
过程
受体细胞 特点
花粉管 在植物受粉后，花粉管还未愈合前，剪去 体细胞 简便、经济，
通道法 柱头→滴加目的基因→目的基因借助花粉 或受精 我国科学家
管通道进入受体细胞
卵 独创
显微注 射法
受精卵
最为有效地 将目的基因 导入动物细 胞的方法
④大小合适，便于操作
⑤对受体细胞无害
__质__粒___（常用）、λ噬菌体的衍生物（作用对象：大肠杆菌等受体）
种类及作用对 象
__动__物__病__毒___（作用对象：动物细胞）
植物病毒（作用对象：植物细胞）
1. 根据你所掌握的知识，你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 提示：防止外来病原物的侵害，切割外源DNA，保护自身。
3） 基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来 自__受__体__细__胞___。 [解析] 噬菌体属于病毒，病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自受体细胞。
考点二 基因R操作过程中，不需要在反应体系中加入ATP。( × ) 3. 如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接 人工合成。( √ ) 4. 启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于载体DNA的首端，是RNA聚合酶识 别和结合的部位。( × ) 5. 基因表达载体中复制原点的作用是诱导目的基因的转录。 (×) 6. 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子 植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。( √ )
2. 请据图回答下列问题： 据图可知EcoRⅠ限制酶的识别序列是__—__G_A_A__T_ _T_C_—___;切口类型是__黏__性__末__端___；切点是在_G___ _—__A_之间，由图解可以看出，限制酶的作用特 点是识别双__链__D_N__A_分__子__的__某__种__特__定__核__苷__酸______ 序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸 之间的磷__酸__二__酯__键_____断开。
3. （选修3 P6寻根问底）DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 提示：不是。DNA连接酶发挥作用时不需要模板，连接的是两个DNA片段；DNA 聚合酶发挥作用时需要模板，作用是将单个核苷酸依次连接到单链3′端。
4. ）联系你已有的知识，想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?
提示：含有某种限制酶的细胞，自身DNA不具有这种酶的识别切割序列，或识别 序列被修饰，使限制酶不能将其切开。
切割下来需要切两处，同时产生四
一种特定的核苷酸 个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是
黏性末端
原核生物DNA分子中不存在该酶的
识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
黏性 末端
限制酶
（3）载体
作用
将目的基因运送至受体细胞
①能自我复制
条件
②有一个至多个__限__制__酶___切割位点，供外源DNA插入其中 ③有__标__记__基__因___供重组DNA的鉴定和选择
3） DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有__E_·_co_l_i__D_N_A__连__接__酶___和 __T_4_D_N_A__连__接__酶___，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_T__4D__N_A__连__接__酶___。
考向二 载体的作用和特点
2. 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（ Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用B amHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接 反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转 化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插 入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：