SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

SDS Triton Tween EDTA DTT -巯基
-X100 20,60,80
乙醇
BCA 5% 5% 5%
10mM 1mM 1mM
Bradf 0.1% 0.1% 0.06% ord
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
5mM 1M
✓
凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
❖制备浓缩胶(浓缩胶)
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。
分离胶 pH 8.8
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样品处理
Sample buffer
1. SDS
2. - mercaptoethSanaoml ple buffer
实验原理
• 分子筛效应
pH6.8ຫໍສະໝຸດ 5%pH8.810%
Gly- Gly-
Gly-Gly-
Gly-Gly-
CGl-y- CGl-y-CGl-y- CGl-y-CGl-y-CGll-y- CGl-lyC-Gl-lCyl-G- ly-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应
实验原理
• 浓缩效应
pH6.8
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl-Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
pH8.8
快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速
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蛋白质是29：1 核酸是19：1
( H 2 C C H )n
CO
NH2
H 2C C H
( H 2 C C H )n H 2 C C H
CO
CO
CO
HN CH2 NH
NH2
HN
CH2
NH
CO
H 2C C H
( H 2 C C H )n
CO
CO H 2C C H
NH2
( H 2 C C H )n
CO
NH2
7. “鬼带”
“鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会出 现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条 带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程 中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重 新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量 要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标 条带有相同的免疫学活性， WB 反应中可见其能与目标 条带对应的抗体作用。
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电泳过程中的不正常现象 1 “微笑”现象
指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，主要是由于凝胶的中 间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
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2 皱眉现象
由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶 和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝 胶聚合不完全 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
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Bradford法
• 考马斯亮蓝G250染色法 • 此法根据蛋白质与染料相结合的原理设计
的。 • 与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应
迅速而稳定。 • 反应化合物在595nm处有最大光吸收值 • 灵敏度25 mg/ml~200 mg/ml
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注意各方法适用条件—范围
蛋白质的染色方法
• 氨基黑
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
• 考马斯亮兰R-250，G250
G250测定蛋白含量
• 银染
敏感度最高，常应用于蛋白质双向电泳
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H 2C C H CO NH2
H 2C C H CO
HN
+
CH2 NH
过硫酸铵是催化剂
TEMED是加速剂
H 2C
聚合原理
*Acr有神经毒 性
3. bromophenol blue
4. Glycerol
金属浴(100℃)中15min
s s
SH
SH
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❖上样及电泳
通电
加入电极缓冲 液pH 8.3
加入样品
浓缩胶 pH 6.8
开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚 蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
分离胶 pH 8.8
实验原理
• 浓缩效应
pH6.8
5%
Gly- Gly-
Gly- Gly- Gly- Gly-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子 (pI 5.97) 蛋白质离子
pH8.8
10%
Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl-Cl-
快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速 浓缩效应
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处理办法： 在加热煮沸后， 再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇， 以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来 阻止还原剂的氧化。
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谢谢!
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附：蛋白质的提取与定量方法
• 蛋白质提取
• 不同来源，不同的方法
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提取原 则
200ml
100ml
10ml
10ml
TOTAL
10ml
5ml
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❖制备分离胶(下胶)
封水或饱和 正丁醇溶液
出现明显界面时， 分离胶凝聚完成 （ 10~20min）
倒出水或正丁醇， 并用加样枪/滤纸 吸干
加入分离胶溶 液 pH 8.8
✓ 封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。
• 细胞的破碎 • 合适的裂解液 • 一般在冰上进行 • 加入适当的蛋白酶抑制剂
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哺乳类细胞的裂解液-RIPA
• 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), • 150 mM NaCl, • 1% NP-40（乙基苯基聚乙二醇，常用非离
子性去垢剂 ）, • 0.1% SDS
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3 “拖尾”现象 样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大
解决办法： ➢加样前离心 ➢选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液 ➢加增溶试剂 ➢降低凝胶浓度
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4 “纹理”现象 样品中的不溶性颗粒引起的
解决办法： ➢增加溶解度 ➢离心除去不溶性颗粒
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SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
Staking gel Separating gel
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电流路径
负极 凝胶
正极
外槽
——
内槽
——
外槽
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实验过程
5. 染色、脱色 A. 染色20分钟
考马斯亮兰R250
B. 脱色30分钟至2小时
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SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
以双缩脲为基础的方法
1. BCA法 bicinchoninic acid 二奎啉甲酸法
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以双缩脲为基础的方法
2. lowry法 folin酚法 磷钨酸和磷钼酸 钨蓝、钼蓝
BCA和Lowry法比双缩脲灵敏高100倍 0.005 - 0.10 mg/ml
C H H 2C C H H 2C C H H 2C C H H 2 C C H
CO
CO
CO
CO
CO
CO H 2C C H
H 2C C H CO
NH2
NH2
NH2
NH2
HN
CH2
NH
HN CH2 NH
CO H 2C C H
n决定了交联度
CO
H 2C C H
( H 2 C C H )n
CO
NH2
与浓度一起决定孔径的大小
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实验原理
• 分子筛效应
lgMw
lgMw=-bx+K
pH6.8
5%
pH8.8
10%
电泳迁移率
Pr Mw在11.7-165Kd
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实验原理
蛋白质移动的距离
迁移率=
脱色后的胶长
染色前胶长 指示剂移动的距离
pH6.8
5%
pH8.8
10%
• 分子筛效应
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
实验流程
配胶
配分离胶(下胶) 配浓缩胶(上胶)
样品制备
电泳（1.5~2h）
染色（20min）
脱色（30min~2h）
分析
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实验过程
1.装配装置
BG-verMINI型迷你垂直电泳槽 (北京百晶)
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蛋白酶抑制剂
抑制剂
靶蛋白酶
PMSF 苯甲基磺酰氟 EDTA
丝氨酸蛋白酶 金属蛋白酶
Leupeptin 亮肽素 Aprotinin 抑肽酶 Pepstatin 抑肽素
丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶 胰蛋白酶及糜蛋白酶 天冬氨酸蛋白酶
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定量方法
• 紫外吸收法 • BCA法 • Lowry法 • Bradford法
5 偏斜现象 电极放置不平行或加样位置偏斜引起
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6-1 某一条泳道条带太宽 加样量太多或者加样孔泄露引起
6-2 整块胶分离的条带太宽 主要是未浓缩好的原因
处理办法： • 适当增加浓缩胶的长度； • 保证浓缩胶贮液的 pH 正确 （6.7） ； • 适当降低电压；
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实验过程
2.凝胶配制
*Acr有神经毒 性
下胶(分离胶)10% 上胶(浓缩胶)5%
H2O 30%Acr-Bis
3.9ml 3.3ml
3.4ml 0.83ml
Buffer (含SDS) 10%APS
TEMED
(1.5M Tris-Cl pH8.8) (1M Tris-Cl pH6.8)
2.6ml
0.68ml
Gly-
Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
PH8.8
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Pr为什么带负电
加样缓冲液
巯基乙醇
断二硫键
C
SDS
断化学键
N
H3C
SO 4Na带负电荷
SDS：Pr=1.4:1
甘油
促沉
氨基酸侧链
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二硫键 盐键 疏水作用 氢键
溴酚兰
? Tris
染色前
实验原理
迁移率= “蛋白质移动的距离”
指示剂移动的距离
L1 X L3
L2 X L4
染色后
Lx
蛋白质的带在哪呢？
L1
L4
L3
L2
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PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDS-PAGE MW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.
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Marker 97 66
44
29
20 14
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
Tanon-1600数码凝胶图像分析系统
GIS 1D 图像分析软件(Ver. 4.00)
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诱导前后蛋白表达差异
IPTG诱导表达His-GFP融和蛋白（31.9kD）。 1为诱导前，2～6分别为诱导0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。
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实验原理
1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移 动，这种现象称为电泳。
电荷
分子大小 分子形状
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实验原理
• 浓缩效应
PH6.8
Pr-
Pr-
Pr-
Cl-
Cl- Gly- Cl-
Cl-
Cl-
Cl-Gly- Gly-
GlyCl- Gly- Cl- Gly-
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
实验原理
• 分子筛效应
pH6.8
5%
pH8.8
10%
Gly- Gly-Gly- Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-GlyCl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl- Cl-Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应