麒麟菜中多肽的提取及多肽的抗血小板聚集和抗菌活性

麒麟菜中多肽的提取及多肽的抗血小板聚集和抗菌活性
刘彬;余华军;伍俊;崔运忠;张海涛
【摘要】目的：从天然活性物质中寻找新的抗血小板药物是筛选新型抗血小板聚
集药物或药物前体的一个重要策略。

文中建立从麒麟菜中纯化多肽的方法，并研究其抗血小板聚集、抗菌的活性。

方法用酸处理和sephdexG⁃50凝胶层析法从麒麟菜中提纯小分子多肽，菌株用LB培养基培养，收集对数生长期的细菌，分别加入对照品（即样品中加入0μg／mL的多肽）、不同浓度的多肽（5、10、20、
40μg／mL）、青霉素（64μg／mL）的样品在37℃培养24 h后取出。

用比浊法检测对照品和多肽样品对大肠埃希菌（D1314）和金黄色葡萄球菌（s．agr＋、RN4220）生长的影响，采用全血血小板聚集仪检测麒麟菜低分子多肽对凝血酶诱导的血小板聚集的影响。

结果50、100、150、200 g麒麟菜多肽提取得率分别为0．382％、0．405％、0．389％、0．389％。

经凝胶层析纯化样品在
SDS⁃PAGE中显示为单一蛋白质条带。

相对分子质量约为3000。

大肠埃希菌
（ D1314）、金黄色葡萄球菌（RN4220、s．agr＋）对多肽样品及青霉素较敏感，且随多肽浓度增加，抑菌效果增强。

与对照品血小板最大聚集率
[（9．00±3．74）Ω]比较，2．5、5、10μg／mL多肽样品[（4．98±0．82）、（4．33±0．47）、（2．25±0．50）Ω]和血栓通[（5．08±1．21）Ω]明显减
少（ P＜0．01），与血栓通比较，多肽样品对血小板最大聚集率减少（ P＜0．05），且呈剂量依赖性。

2．5、5、10μg／mL多肽样品、血栓通对血小板聚集的抑制率分别为44．7％、51．9％、75．0％。

结论文中建立的方法可从麒麟
菜中成功提取到纯化的麒麟菜低分子多肽，且能显著有效抑制血小板聚集及细菌的生长。

提取的多肽是潜在的抗血小板药物。

%Objective Eucheuma is rich in nutrients and can be an important raw material of food after processed.
This study was designed to establish a feasible method of purifying polypeptides from eucheuma and investigate their activity against platelet aggre⁃gation and bacterial growth. Methods We extracted peptides from eucheuma with acidic solution, detected the effects of different doses of small molecular polypeptide ( 0, 5, 10, 20, and 40μg/mL) on the growth of Escherichia coli ( D1314) and Staphylococcus aureus (s.agr+, RN4220) using the method of turbidity, and analyzed the anti⁃platelet aggregation activity of the peptides with a whole blood aggregometer. Results The rates of peptides extracted from 50, 100,150, and 200 g of eucheuma were 0.382%, 0.405%, 0.389%, and 0.389%, respectively. The purified sample exhibited a single band on SDS⁃PAGE. The relative molecular weight of the peptides was about 3kD. The extracted peptides inhibited the growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, and thrombin⁃induced platelet aggregation in a dose⁃dependent manner, with inhibition rates of 44.71%, 51.86%, and 75.00%, respectively. Conclusion The present method can be used to successfully purify low⁃molecular⁃weight peptides from eucheuma and effectively inhibit platelet aggre⁃gation and bacterial growth. The peptides extracted is a potential anti⁃platelet aggregation agent.
【期刊名称】《医学研究生学报》
【年(卷),期】2016(029)010
【总页数】4页(P1036-1039)
【关键词】麒麟菜;多肽;血小板聚集;抗菌
【作者】刘彬;余华军;伍俊;崔运忠;张海涛
【作者单位】524000 湛江，广东医学院生物化学与分子生物学教研室;524000 湛江，广东医学院生物化学与分子生物学教研室;524000 湛江，广东医学院生物化学与分子生物学教研室;521000 海口，海口四度实业有限公司;524000 湛江，广东医学院生物化学与分子生物学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R558
[DOI] 10.16571/ki.1008-8199.2016.10.006
血栓性疾病是全球发病率和病死率最高的疾病。

目前，治疗和预防血栓性疾病的药物主要包括抗血小板、抗凝治疗和溶血栓药物[1-2]。

抗血小板类药物具有抑制血小板黏附、聚集和释放，防止血栓形成的功效[3-4]，同时可有效地预防心血管疾病的发生[5-6]，延长心血管病患者的生存期[7]。

从天然活性物质中寻找新的抗血小板药物是筛选新型抗血小板聚集药物或药物前体的一个重要策略。

麒麟菜(Eucheuma)是一种海洋红藻[8]，又称鸡脚菜、鹿角菜，盛产于我国海南、广东、广西及东南亚等沿海地区[9]。

麒麟菜富含低分子多糖和卡拉胶，现已开发为重要的食品来源[10]。

本文建立了麒麟菜中多肽的提取方法，并观察了其抗血小板聚集和抗菌活性[11]，为麒麟菜开发成为新型的抗血小板药物和抗菌药物提供了实验基础。

1.1 实验材料
1.1.1 仪器自动低压液相色谱分离层析仪(上海，嘉鹏)，CF16RX冷冻离心机(日本)，VARIOSKAN FLASH连续光谱荧光酶标仪(美国)，FluorChem TM SP全自动荧光化学发光可见光数字图像分析系统(美国)，Bio-Rad垂直电泳槽(美国)，
UV-2100分光光度计(上海，尤尼柯)，全血血小板聚集仪(美国Chrono-Log)。

1.1.2 试剂麒麟菜(收集于海南琼海)；Sephadex G-50 (Pharm)，四甲基乙二胺，丙烯酰胺，N，N一甲叉双丙烯酰胺，考玛斯亮蓝，十二烷基硫酸钠，甘氨酸，蛋白胨，酵母提取物，凝血酶(鼎国)，血栓通注射液(广西梧州制药集团股份有限公司，批号：14060210，35 mg/mL)；其余为国产分析纯试剂。

1.2 方法
1.2.1 麒麟菜中多肽的制备方法①清洗：取麒麟菜，自来水反复清洗2～3次去除
其表面的泥沙杂物，再用蒸馏水反复冲洗1～2次，晾干称重后备用。

②酸液提取：将上述晾干过后的麒麟菜置于20 mmol/L的盐酸溶液中浸泡24 h，以除去麒麟
菜表面的天然色素糖蛋白，然后更换盐酸溶液，将浸泡过后的麒麟菜和盐酸溶液一起用匀浆机匀浆打碎，匀浆过后，匀浆液用离心机以离心半径12 cm、8000
r/min离心30 min后收集上清液，但上清液较为黏稠，加入1.5%的KCl后按上
述离心的方法再次离心，收集上清液备用即可。

③计算多肽的提取得率：
多肽样品提取得率(%)=多肽(g)/麒麟菜干重(g)×100%
1.2.2 凝胶层析分离多肽与多肽定量将上清液用Sephadex G-50分离，20
mmol/L盐酸洗脱，流速1.0 mL/min，收集280 nm具光吸收峰物质，共收集2个洗脱峰[12]。

预实验结果发现麒麟菜的主要生物活性物质仅集中在第2个洗脱峰。

1.2.3 洗脱峰样品聚丙烯酰胺凝胶电泳分析加入等体积的上样缓冲液( 62.5
mmol/L Tris，10%甘油，2% SDS，0.02%溴酚兰，5% B-巯基乙醇)，12%的分离胶：H2O 1.6 mL，30%丙烯酰胺溶液2.0 mL，1.5 mol/L tris-HCl( pH=8.8)，1.3 mL，10% SDS 0.05 mL，10%过硫酸铵0.05 mL， TEMED 0.004 mL。

电泳缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH=8.3。

加
样前将样品煮沸5 min后开始电泳，先恒压90 V，溴酚蓝到分离胶时，将电压升至200 V，待溴酚蓝快到达分离胶底部时，停止电泳，剥离胶[13]。

1.2.4 测试菌株与抑菌试验大肠埃希菌(D1314)、金黄色葡萄球菌(s.agr+、
RN4220)从中国生物制品所购进。

菌株用LB 培养基培养，收集对数生长期的细菌，分别加入对照品(即样品中加入0 μg/mL的多肽)，不同浓度的多肽(5、10、20、40 μg/mL)，青霉素(64 μg/mL)37 ℃培养24 h后取出样品[14]，于630 nm波
长测定浊度，确定细菌的生长速度。

1.2.5 多肽对凝血酶诱导的血小板聚集的影响新鲜猪血取完后用柠檬酸钠抗凝剂1∶9抗凝即得抗凝猪全血。

静置1～2 h后，猪全血和等渗盐水各取0.5 mL，分
别与多肽(0、2.5、5、10 μg/mL)和血栓通(100 μg/mL)温育10 min，加入10
μL凝血酶(100 U/L)诱导血小板聚集反应，用全血血小板聚集仪记录聚集情况[15]。

抑制率计算公式：
抑制率(%)=(对照组-实验组)/对照组×100%
1.3 统计学分析应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差±s)
表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，
以P≤0.05表示为差异有统计学意义。

2.1 麒麟菜中多肽成分的提取得率取50、100、150、200 g麒麟菜干品按照
1.2.1所述的制备步骤分别得到0.191、0.405、0.583、0.794 g多肽样品，多肽
提取得率分别为0.382%、0.405%、0.389%和0.389%。

见表1。

2.2 麒麟菜中多肽的电泳分析电泳结果显示，经过纯化获得的洗脱峰，相对分子
质量与胰岛素相似。

胰岛素经SDS-PAGE电泳显示3000左右的单链。

2.3 麒麟
菜中多肽对不同细菌的抑制效果小分子多肽样品主要存在于洗脱峰，观察此收集
峰对大肠埃希菌(D1314)、金黄色葡萄球菌(s.agr+ 、RN4220)的抑制效果。

浊度结果显示，这3种菌株均对多肽样品和青霉素较为敏感，随着多肽剂量的增加，
高剂量多肽样品抑菌效果增强。

与对照品比较，除5 μg/mL多肽样品对RN4220抑菌效果不明显，其余差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.4 麒麟菜中多肽
抗血小板聚集的作用 2.5、5.0和10 μg/mL多肽对凝血酶诱导的血小板聚集的抑
制率分别为44.7%、51.9%和75.0%，与对照比较，多肽样品血栓通对血小板最
大聚集率差异有统计学意义(P<0.01)；与血栓通比较，多肽样品对血小板最大聚
集率差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性。

见表2。

麒麟菜来源于可食用的海洋植物，无毒副作用，富含膳食纤维、多糖和矿物质，但必需氨基酸和脂肪酸含量较低[16-17]，被用作很多食品的原料，也可直接食用[16]。

各种研究资料显示麒麟菜中的卡拉胶、寡聚糖具有能抑制细菌生长，抗肿瘤等生物学活性[17-18]。

本课题组用自己建立的多肽提取方法从麒麟菜中纯化出一
类小分子多肽，并发现获得的多肽具有显著的抗血小板聚集，抑制细菌生长的活性，为进一步开发和利用这种海藻资源奠定基础。

本文采用酸提法和SephadexG-50凝胶层析从麒麟菜中分离出2组蛋白质(肽)成分。

在提取过程中按比例加入1.5% KCl来去除麒麟菜匀浆液中大量的卡拉胶，因为在凝胶体系中，K+参与了卡拉胶的胶凝过程，并且在一定质量分数范围内能使
凝胶强度提高，使匀浆液中的黏性物质能全部离心沉淀下来[19]。

经抑菌试验发现，凝胶层析的收集峰2能有效抑制大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的生长。

SephadexG-50凝胶层析的相对分子质量排阻范围为5000，所以收集峰2洗脱的蛋白质相对分子质量小于5000，属于肽类的分子量范围。

且收集峰2的电泳结果显示其相对分子质量较小，与胰岛素类似，属于小分子多肽类，说明我们实验获得的小分子量多肽是3000左右(纯净的麒麟菜多肽)。

研究结果表明，麒麟菜中多肽可以显著抑制凝血酶诱导的血小板聚集且呈剂量依赖性，其抑制血小板聚集的作用强于血栓通注射液。

血栓通注射液的主要成分是三七总皂苷，具有显著促进血液循环和缓解血瘀。

本研究从麒麟菜中提取出一类小分子多肽，并发现其可以抑制血小板聚集和细菌生长，但其药理作用还待进一步研究。

本研究建立了一种方法能有效地提取麒麟菜中的多肽，且实验操作较为简单方便，
我们的实验结果表明麒麟菜可以在制备抗血小板聚集、抗菌药物中应用，或利用麒麟菜作为抗血小板聚集、抗菌药物的前体进行改造。

论著
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