16 临床荧光PCR检测影响因素的研究

定量结果相关性比较
保存5年试剂与新试剂比较
图：2010年12月与2014年10月试剂定量结果相关性比较
通用
通用
R²= 0.992 R=0.996
通用
通用
通用
通用
通用 通用
通用
通用
通用
通用
通用
通用
通用
通用
通用
通用
试剂配制存放时间、条件对检测结果 的影响
室温避光保存，不加酶
室温曝光存放，不加酶 冷藏避光保存，不加酶 室温避光保存，加酶 冷藏避光保存，加酶 冷冻避光保存，加酶 室温曝光存放，加酶
过滤液再过柱5次取得核酸（滤过液再次核酸提取）
原液 1滤 原液 1滤 2滤 3-5滤 3-5滤 原液
2滤
1滤
2滤 3 、 4、 5滤
高浓度标本过滤
中浓度标本过滤
低浓度标本过滤
滤过液再进行核酸提取5次数据
滤过次数
原液
DNA含量
1滤
12.22 （-3.3）
2滤
3滤
4滤
5滤
高（CT值） 中（CT值） 低（CT值）
临床荧光PCR诊断试剂值得商讨的几个问题
检测低限值：HBV DNA<30IU/ML(10-20IU/ML)。 HCV RNA敏感性报告<50IU/ML？，无检测临界值实验方案和要求。 样品进样量：乙肝不少于200μl(不应强调)！ 纯化核酸进样量：乙肝核酸加样量不少于20微升、反应体积不少于40微升！ 磁珠参与PCR扩增不适合！ 线性范围、精密度的界定：应提供商用的血清盘! 防污染性能评估指标：未强调！无法排除具有先天污染缺陷的试剂盒。
保守计算：总丢失率：60%-80%
保证高效吸附和牢固、减少洗涤次数、磁珠参与PCR扩增
不同磁珠参与PCR扩增对检测结果的影响
裂解液1 裂解液1
A 公司试剂盒磁珠
B 公司试剂盒磁珠
荧光定量PCR扩增试剂 性能评估
1. 检测低限值（Limit of Detection）：10IU?、20IU?、30IU?
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
23.39 31.34 18.12 34.65 34.43 22.42 34.21 24.06 No Ct 32.65 15.51 13.62 27.20 34.36 31.97 38.14 25.82 28.70 32.67 33.23 31.16 30.28 21.73 No Ct 23.83 25.17 15.70 25.94 28.23 34.25 36.96 32.54 29.67 33.21 20.75 32.44 24.72 12.81 19.12 26.81
核酸制备方法（纯度？效率？丢失？）
血清、血浆或细胞，干扰 物质！
煮沸法 PEG等
DNA/RNA核酸纯化皆可，血清 、血浆或细胞，纯化彻底！
微量核酸 释放剂法
核酸制备
加热洗 基于磁珠 脱！加 的仪器或 重污染！ 手工提取
层析柱法
主要用于RNA检测，血清、 血浆或细胞，纯化彻底！
不同方法的选择、问题与对策
磁珠或层析柱胍盐提取核酸多步骤的弊端
乙醇在核酸提取中的利与弊！ 核酸提取过程中的废物处理！ 磁珠核酸洗脱：核酸丢失与污染！ 磁珠参与PCR反应的干扰！
洗脱（加热）
核酸丢失
漂洗
核酸丢失与污 染
核酸吸附
病毒裂解
温度、操作等
吸附效率
核酸丢失与实验室污染
磁珠法核酸丢失（ROCHE MG-P2.0）
0
0
0
层析柱反复洗脱（层析柱反复洗脱）
原液 1洗 2洗 原液
1洗
2洗 3洗
原液 1洗
2洗
3-7洗
4-7洗
3洗 4洗
5洗
高浓度标本洗脱
中浓度标本洗脱
低浓度标本洗脱
层析柱反复洗脱核酸数据（HBV DNA）
原液
8.92 高（CT）
1洗
11.9 -2.95
2洗
14.5 -2.67 29 -2.12 34.9 -1.84
阴性质控的考核：做多少？ 交叉污染实验：阳性病毒量足够高，8次方。48T或96T
阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性 阳性 阴性 阳性 阴性 阴性 阳性 阴性 阳性
2014-10 A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2 A3 B3 C3 D3 E3 F3 G3 H3 A4 B4 C4 D4 E4 F4 G4 H4 A5 B5 C5 D5 E5 F5 G5 H5
标本号 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
18.68
19.07
18.08
18.75
18.94
1液加热对照得到的Ct值:
原液 高 中 低
9.27 23.85 35.19
加热洗脱
9.29 23.76 34.05
加热洗脱
原液
磁珠法核酸提取丢失率的计算
以HCV RNA为例
吸附丢失：20% 漂洗：10% 磁珠核酸洗脱：30%-50%
8.92 23.97 31.1
13.57 14.89 15.66 16.4 （-1.35） （-1.32） （-0.77） （-0.74）
25.96 27.05 27.34 28.32 28.49 （-1.99） （-1.19） （-0.29） （-0.99） （-0.17）
33.72 39.53 （-2.62） （-5.81）
2010-12
标本号
Ct
定量值
A7 B7 C7 D7 E7 F7 G7 H7 A8 B8 C8 D8 E8 F8 G8 H8 A9 B9 C9 D9 E9 F9 G9 H9 A10 B10 C10 D10 E10 F10 G10 H10 A11 B11 C11 D11 E11 F11 G11 H11
四种核酸提取方法的污染数据
荧光定量PCR试剂效期研究 及使用质量因素
过期的荧光定量PCR试剂可否使用？
保存五年PCR试剂敏感性研究图，针对相同的标准品
Lot：20101231 Det:20141025
Lot：20121223 Det:20141025
Lot：20141001 Det:20141025
2. 线性范围的确定
2.0×109IU/ml 20IU/ml
10IU/ml
5IU/ml
3. 重复性（精密度）
20IU/ml
2.0×108IU/ml
2.0×105IU/ml
2.0×103IU/ml
2X10^9 IU/ml
20IU/ml
5 IU/ml
5 10 20 30
扩增效率
是否为先天易污染污染的试剂盒？
Ct 22.21 30.70 17.56 33.83 34.71 21.36 33.89 24.07 No Ct 32.01 14.64 12.39 25.96 33.15 32.41 35.45 24.86 28.49 31.70 32.03 30.08 29.32 20.42 No Ct 22.86 24.12 14.45 24.31 26.60 33.95 37.97 31.46 28.76 32.74 19.52 31.37 23.48 11.27 17.74 26.31
定量值 2.879E+06 9.552E+03 6.570E+07 1.158E+03 6.433E+02 5.102E+06 1.114E+03 8.255E+05 <1 3.952E+03 4.690E+08 2.123E+09 2.308E+05 1.830E+03 3.018E+03 3.914E+02 4.844E+05 4.217E+04 4.850E+03 3.884E+03 1.450E+04 2.416E+04 9.583E+06 <1 1.860E+06 7.981E+05 5.330E+08 6.997E+05 1.499E+05 1.071E+03 7.170E+01 5.719E+03 3.512E+04 2.413E+03 1.760E+07 6.089E+03 1.228E+06 4.507E+09 5.835E+07 1.827E+05
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
阳性
阴性
阴性
阳性
交叉污染的实验设计：某核酸提取仪109 与阴性对照间隔进行核酸提取并检测。
所有的核酸提取仪都有污染的发 生！
临床荧光PCR检测影响因素
的探讨
中国人民解放军第 302 医院
王海滨
PCR技术在临床应用的几个代表性时间
1998年卫生部临检中心宣布停止临床应用（污染） 2003年SARS，在实验室进行检测，电泳法！ 2009年H1N1临床诊断和治愈出院的评判指标 2014年麻疹爆发流行在临床上的早期诊断 2015年HBV/HCV/HIV在血战筛查试用
26.9 -2.91
31.1
33.1 -1.99
低（CT）
HCV RNA核酸磁珠再洗脱
第二次磁 珠洗脱
高浓度标本反复洗脱得到的PCR曲线和Ct值:
高浓度标本
原液 8.92 9洗 1洗 11.87 10洗 2洗 14.54 11洗 3洗 15.28 12洗 4洗 15.75 13洗 5洗 15.92 14洗 6洗 16.41 15洗 7洗 16.44 16洗 8洗 17.67 17洗
移液器和离心机专用。
一室化
COBAS 系统提示：一室化PCR实验室的可行性
尤其是磁珠核酸提取方法：直接掺入！ 非本室工作人员 请勿入内！
实时荧光PCR扩增仪器的选择与维护
热模块、光学模块、软件功能
荧光PCR试剂盒的质量评价
核酸制备：创新性如何？先天无污染缺陷 PCR扩增试剂：评价性能指标 PCR扩增试剂的使用与影响因素 易防污染性能评价
……
临床荧光PCR定量检测质量环节 与影响因素
熟悉因素环节！方能提高质量！
临床荧光PCR检测质量环节
实验室设置要求的目的：防污染！
一室化PCR实验室的可行性与设置
荧光PCR扩增仪器：手机、汽车等。设备耗材
国产SLAN荧光PCR仪器，YOU YOU TOO
如何选择具有防污染特质的“三少两高”试剂盒？
核酸丢失少、操作步骤少、污染机会少，扩增效率高、精密度高。
人的因素很重要！学习公司的管理模式。
分类：学习型、工作型、示教型、专家型
实验室质量意识的培育：打造狼的团队、苹果产品的业绩
质量意识究竟差多少？
实验室设置
试剂配制 核酸提取 PCR扩增 开放产物分析
风向
分区目的 减少或避免污染！风向、温湿度、易清洁构造。
hcv血清样本室温保存对检测结果的影响cobas数纯化核酸保存条件时间与其稳定性日期天定量值427e06468e06408e06415e06352e06331e06375e06212e06log10663定量值376e04275e04300e04215e04220e04168e04111e04665e03log10458定量值145e03144e03117e03111e03631e02652e02317e02200e02log103161011121314定量值154e06779e05174e05531e04161e04840e03495e03log10619定量值616e03256e03148e03734e02455e02272e02253e02log10379定量值200e02689e01192e01ntntlog10230血清样本在28保存对检测结果的影响663633369458240316184000100200300400500600700800对照10111213141061041033次方hcv血清保存条件室温20存放时间病毒载量ct病毒载量ct病毒载量ct1d188e033d185e033091479e03295410e0329736d424e023304289e033027401e032989d000e00650e032829177e03302112d000e00304e032806238e03284215d000e00247e032844266e03283318d000e00221e032895412e03280321d000e00844e032824585e03287828d000e00165e032923247e03286435d000e00106e032923247e03286442d000e00454e023071199e032864通用通用通用通用通用通用通用通用通用1d3d6d9d12d15d18d21d28d35d42d49d56d63d70d3次方hcv血清在三种存储条件下随时间的变化25205次方hcv血清保存条件2520存放时间病毒载量ct病毒载量ct病毒载量ct1d132e053d977e042506227e052381184e0524126d520e04261351e052334208e052419d208e023339282e052269183e05233312d00
2h对照组：
反应液未加酶和加酶后室温曝光存放2小时
然后加酶进行PCR实验
室温 未加酶
3洗
15.3 -0.74 30.4 -1.44 36.1 -1.21
4洗
15.8 -0.47 30.6 -0.19 36.9 -0.77
5洗
15.9 -0.17 31.1 -0.5 0
6洗
16.4 -0.49 31.6 -0.45 0
7洗
16.4 -0.03 31.9 -0.27 0
24 中（CT）
1.886E+06 7.521E+03 7.349E+07 7.527E+02 8.747E+02 3.694E+06 1.019E+03 1.184E+06 <1 3.011E+03 4.502E+08 1.678E+09 1.332E+05 9.210E+02 4.847E+03 6.629E+01 3.492E+05 4.714E+04 2.982E+03 2.023E+03 8.501E+03 1.567E+04 5.981E+06 <1 1.392E+06 5.453E+05 3.959E+08 3.201E+05 6.510E+04 9.932E+02 1.511E+02 3.260E+03 2.395E+04 2.053E+03 1.177E+07 3.487E+03 7.500E+05 2.939E+09 3.671E+07 1.744E+05