小鼠过氧化氢酶的制备与测定

前言
过氧化氢酶是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。

过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。

过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。

过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。

过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。

过氧化氢酶(CAT)是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。

它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。

CAT作用于过氧化氢的机理实质上是
H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。

H2O2浓度越高，分解速度越快。

几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。

其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。

CAT是红血素酶，不同的来源有不同的结构。

在不同的组织中其活性水平高低不同。

过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。

过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。

过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。

在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢，以
保证成品是不含过氧化物的。

它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。

近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。

一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。

本实验所提取的过氧化氢酶来源于小鼠，其分子量约为
238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。

溶于水,
几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。

本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。

目录
一、实验方案
二、实验目的
三、实验原理
四、实验过程
五、实验结果
六、实验讨论
七、注意事项
八、结果误差分析
九、结语
十、致谢
【附】主要参考资料
一、实验方案:
二、实验目的
熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。

熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。

三、实验原理
匀浆原理：
分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。

过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。

过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。

根据上述原理选择0.05mol/L ，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。

制备过氧化氢酶
层析
匀浆
透析
盐析
过氧化氢酶测定
纯度及分子测定（SDS-PAGE ）
蛋白含量（lowry 法）
米氏常数测定（Lineweaver-Burk ）双倒数作图法
盐析原理：
蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。

通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。

在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。

透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。

选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。

层析原理：
凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。

采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。

四、实验过程
一、实验器材
1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）
2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R 高速冷冻离心机，CU600 型电热恒温水箱，DYY-8L 型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H 水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱
二、实验方法
（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液
【器材】
1、动物：成年小鼠
2、器材：手套、镊子，剪刀，肾盘，冰袋，电子天平，托盘天平，组织捣碎机，10mL匀浆管，冰浴盒，吸量管，滴管，10ml、50mL量筒，100mL烧杯，50mL锥形瓶，玻璃棒，离心管，离心机，制冰机，4℃冰箱，纱布，滤纸
3、试剂：0.05mol/L醋酸-乙醇（23.5％）缓冲液，pH4.0；氯仿
【方法】
1、颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏（按6g计算，不称重）；
2、加入肝重8.5倍体积（51ml）的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇，），用组织捣碎机匀浆1-3min（三组合并一块匀浆，快慢交替使用）。

【留样】不离心，取200ul匀浆液留样，放-20o C保存。

3、冰浴下缓慢滴加肝重0.5倍体积（3ml）的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆30s-1min；匀浆液离心，4℃，7500rpm，30min后，弃沉淀，收获上清液约44ml于100ml锥形瓶中。

4、取匀浆后上清液120uL，加入40 uL 4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。

【留样】另取200 uL匀浆后上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。

（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶
【器材】
1、100mL锥形瓶，冰浴盒，制冰机，JT-1型定时电磁搅拌器，离心管，托盘天平，离心机，透析袋（截留量10KD-20KD，直径2公分），滴管，50mL量筒，5mL吸量管
2、试剂：0.5mol/LNa2SO4；0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液；透析液（20%乙醇，0.1mol/L
pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl），50%甘油。

【方法】
1、冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h（用玻璃棒手动搅拌）；
2、将盐析溶液离心（40C，7500rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀；
3、用肝重4倍体积（24ml）的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）15min ，离心（40C 5000rpm , 10min）后，弃去沉淀，保留上清液；
4、【留样】取盐析后上清样品120ul，用40 uL 4×电泳上样Buffer制样，煮3-5min，备用于SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。

5、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用（不要捞出来）；
6、将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内（注意封口要结实），置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液，上清液的10倍体积）中透析两周，中途更换一次透析液（让学生自带水溶VC瓶）；
7、两周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（40C，7500rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀；
8、用2mL~3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶），离心（40C，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。

9、【留样】取上清样品120ul，用40 uL 4×电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测。

放置-20℃冰箱保存。

10、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用；
11、将收获的样品液（三组样品合并为一组）放入处理后的透析袋中，置于75%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至1~1.2ml收样，放置-20℃冰箱保存。

（三）凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶
【器材】
1、玻璃层析柱（直径1.8cm长45cm）、细乳胶管、夹子、玻璃棉或棉花、细玻璃棒、收集管（试管）、试管架、紫外\可见分光光度计（型号-9100）、锥形瓶、吸量管、滴管。

2、试剂：sephadexG-200，0.1mol/L pH7.8磷酸盐缓冲液
【方法】
1、凝胶的处理：每组取2.5g sephadexG-200葡聚糖凝胶干粉（膨胀体积30~40mL/每克干胶），浸泡于蒸馏水中充分溶胀，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.8) 继续浸泡一天（准备室操作）。

2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫，越薄越好。

将层析柱垂直夹于铁架上，层析柱下端的止水夹夹紧，向柱中加入约5-7cm 高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。

当凝胶颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达35cm（柱床体积约60ml）时为止。

关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。

如凝胶床
表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。

凝胶床表面要保留10cm高的缓冲液。

3、平衡：打开层析柱出口，控制流速为0.3~0.5mL/min (约5-10滴/min，不要超速)，用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)流洗平衡20min。

凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。

4、浓缩样品【前次实验内容中已操作】
5、加样：打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。

用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液1-1.2ml，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。

打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。

待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)小心冲洗壁管上的蛋白质，然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约4cm高。

6、洗脱：洗脱过程中不断补加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)，保持0.3~0.5mL/min（约5-10滴/min）的流速。

洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。

7、收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，每管收集1mL（约20滴）。

收集管依次在407nm和280nm波长下，以空气调零，测定各管吸光度值。

以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。

8、收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，再次测定OD407nm和OD280 nm波长下的吸收值即为最终纯化得到的产物（此次测定以缓冲液调零）。

9、【留样】取2mL纯化产物存样，备用于蛋白浓度及Km值测定，放置-20℃冰箱保存。

10、【留样】取层析纯化样品60uL（浓不浓缩视情况而定），用20 uL 4×电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5min，备用于SDS-PAGE检测，放置-20℃冰箱保存。

（四）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化物酶分子量
【方法】
1.SDS-连续系统扮装凝胶的制备【实验室事先准备好】
2.样品处理：将样品在沸水中水浴2~5分钟。

蛋白质最后浓度一般为0.05~1mg/ml。

3.加样：将凝胶板插入电泳槽固定好，加入电极缓冲液，用微量移液枪依次在各个样品槽内加样。

4.电泳：将电泳槽接在直流电源上，开始电泳，约半小时后待指示染料溴酚蓝（BPB）迁移至下沿约1~1.5cm处，停止电泳。

5.剥胶和固定：电泳结束后，取出凝胶板，用水慢慢冲洗胶面，将胶置于培养皿内，放入固定液，没过凝胶板，固定两小时以上或过夜。

6.染色：将凝胶浸入染色液[1%考马斯亮蓝R-250(CBBR250),40%甲醇（或乙醇）和10%冰醋酸]中，染色0.5~1h，弃去染色液。

7.脱色：加入脱色液[10%甲醇（或乙醇）和10%冰醋酸]，脱色1~3h，其间更换2~3次脱色液，然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清除为止。

【备注】1、待测样品：匀浆后样品、盐析后样品、透析后样品、层析后最终样品。

2、样品上样量：采用4×电泳上样Buffer，各样品均上样20-30ul。

标准蛋白Marker 上样10ul。

（五）Lowry法测定纯化的过氧化物酶浓度
【方法】
1.选取标准蛋白：最好选择与待测样品相同或组成类似的已知含量的蛋白质溶液作为标准蛋白溶液（0.1mg/ml）。

2.配置标准蛋白组：取6支试管并编号，以第一管为空白管，以一定梯度比例向其余试管加入标准蛋白溶液，再加入生理盐水至1ml，加入1ml试剂AB（9：1）混合液混匀后置于50℃水浴10min，冷却后加入试剂C3ml，立即混匀，置50℃水浴保温20min。

3.绘制标准曲线：将各标准溶液在分光光度计上测定650nm处的光密度值。

以各标准溶液浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。

标准曲线必须从零点出发，最好能成一条直线。

4.样品蛋白的测定：将样品蛋白溶液同样处理，查标准曲线计算待测样品蛋白含量。

【备注】：1.待测样品：层析后的纯化样品。

2.样品稀释倍数：需预作后确定，根据层析后样品在280nm下的吸光值（应大于0.2以上）。

3.标准蛋白：为浓度0.2mg/ml的牛血清白蛋白溶液，按操作绘制相应标准曲线用于样品浓度（匀浆产物约稀释200或400倍两个点，层析产物稀释5-10倍）测定。

（六）双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数
【方法】
1.H2O2的浓度的再标定：取洁净锥形瓶2只，各加0.04mol的H2O2溶液
2.0ml和25%H2SO4 2ml。

分别用0.002mol/L KMnO4滴定至微红，记录滴定毫升数，取平均值，计算H2O2的摩尔浓度。

2.过氧化氢酶的稀释
取2ul层析样品加4ml pH7.0，,0.2mol/L磷酸盐缓冲液稀释2000倍
反应测速：取干燥的50ml锥形瓶5只，编号后按图表1操作：
1 2 3 4 5
所加试剂
（ml）
H2O2溶液 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50
蒸馏水0 0.50 1.00 1.50 2.00
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
1:2000稀释
样品
图表1
要求：试剂加入准确而迅速，立即摇匀，记录室温。

终止反应：血液加入后立即计时10分钟，到时立即加入25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，终止酶促反应。

3.滴定用标准0.002mol/L KMnO4滴定，记录各瓶耗KMnO4的毫升数。

4.计算（结果如图表8所示）
【备注】1. 待测样品：层析后的纯化样品。

2. 样品稀释倍数：将样品稀释（匀浆产物稀释5倍、层析产物稀释3000-3500倍），按操作流程用量进行酶活、Km值测定。

五、实验结果
1.凝胶层析法纯化过氧化氢酶洗脱曲线
试管管号
1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
OD407 0.003 0.000 0.007 0.050 0.181 0.272 0.264 0.243 0.145 0.078 OD280 0.022 0.005 0.021 0.160 0.497 0.556 0.441 0.304 0.174 0.113
2.SDS-PAGE 法测纯化的过氧化氢酶测分子量
标准蛋白 分子量 LgMr
样品迁移距离（cm ） BPB 的迁移距离（cm ）
Rf
A
97400 4.989 2.80 5.2
0.538 B 66200 4.821 3.15 0.606 C 43000 4.633 3.80 0.731 D 31000 4.491 4.30 0.827 E 20100 4.303 5.05 0.971 F 14400 4.158 5.15 0.990 待测蛋白
54200
4.734
3.45
5.1
0.676
图表2
图表3
图表4
相对迁移率 Rf=样品迁移距离/BPB 的迁移距离 LgMr （层析蛋白）=4.734 Mr （层析蛋白）=54200
Mr (过氧化氢酶)=4*Mr (层析蛋白)
所以，过氧化氢酶分子量为54200*4=216.8kD
3. Lowry 法测纯化的过氧化氢酶浓度
1 2 3
4 5 6 7 8 标准蛋白溶
液（0.1mg/ml ） 0 0.2 0.4
0.6 0.8 1 1 1 生理盐水
（ml ） 1 0.8 0.6
0.4 0.2 0 试剂
AB(9:1)(ml) 1 1 1
1 1 1 1 1 试剂C
（ml ）
3 3 3
3 3 3
3
3
吸光度 0.000 0.105 0.208 0.322 0.408 0.466 0.054 0.056 蛋白质浓度（mg ） 0.00 0.02 0.04
0.06
0.08
0.10 0.01007 0.01045
因第6组实验误差太大，故忽略第六组数据，做出线性回归方程如下：
y^=5.165x+0.002
图表
5 图表6
由于7号试管稀释了一百倍，其原体积为10vl,所以其浓度为1.007mg/ml; 8号试管原体积为100vl,所以其浓度为0.1045mg/ml 。

4. 双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数
项目 1 2 3 4 5 ①加入H 2O 2的
ml 数 2.5 2 1.5 1 0.5 ②KMnO 4的用
量 11.2 9.1 6 4.1 1.9 ③加入H 2O 2的mmol 数①*0.03625 0.091
0.073
0.054
0.036
0.0181
④剩余H 2O 2的mmol ②*0.002*2.5 0.056 0.0455 0.03 0.0205 0.0095
⑤反应速率③-④ 0.0346 0.027 0.0244 0.0158 0.0086 ⑥底物浓度[s]③/3 0.0302 0.0242 0.0181 0.0121 0.0060 ⑦ 1/v=1/
⑤ 28.881 37.037 41.0256 63.4921 115.9420 ⑧1/[s]=1/
⑥
33.1016
41.3223
55.1724
82.7815
165.5629
匀浆消耗12.7ml KMnO 4， V=2.7mmol/min
线性回归方程： y^=0.654x+7.804
图表7
图表8
5.小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化数据总表
溶液体积（ml ）
蛋白浓度（mg/ml ）
酶活
Km （mol/L ） 分子量 （kD ） IU/ml 总酶活 （IU*
ml ） 比活 （IU/mg ） 回收率% 匀浆产物 0.5 0.95
21600 10800 45474 层析产物
1.5 0.098
13600
20400
92517
62.96
0.0838
216.8
六、实验讨论
1．肝脏的解剖位置在哪，如何取材?
1)肝的体表解剖位置——肝是人体最大的实质器官，呈楔形，左右径为25cm ，前后径约15 cm ，大部分在右上腹，小部分超越正中线达左上腹，上界在右锁骨中线平第5肋上缘，下界齐右肋缘。

（肝脏是人体最大的消化腺，是体内物质代谢和解毒的重要器官，并能分泌胆汁。

）
2)取材：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏。

2．匀浆及离心时的注意事项是什么？
要注意离心的速度不要太快，大概4000r/min ，不注意会造成酶的失活。

3．组织匀浆法的目的是什么？
在保证过氧化氢酶天然活性的状态下，把肝脏细胞打碎，释放出过氧化氢酶。

4．盐析法和透析法的区别在哪里？
盐析法是在中药水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使某些成分在水
图表9 图表10
中溶解度降低，从而与水溶性大的杂质分离。

胶体的盐析是加盐而使胶粒的溶解度降低，形成沉底析出的过程，是胶体的聚沉现象的一种；
透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。

5．溶液的pH对提取过氧化氢酶影响如何？
pH7 左右和30～40 ℃活性最大。

pH为6～8 ，温度20～55 ℃也能够接受。

6．层析时为什么用OD280 与OD407 双重比色？
OD280 是普遍蛋白质的紫外吸光峰值，OD407 是过氧化氢酶的特异紫外光吸收峰值。

两次比色双重保证了能准确选择含有过氧化氢酶的收集管。

7．为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？
醋酸缓冲液的缓冲范围的pH 值在4.7 左右，过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液中溶解度极小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的pH 值在7.8左右，过氧化氢酶在7.8左右的溶解度很大，醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解，这两种缓冲液的作用目的不一样。

8．测定蛋白质浓度的方法有哪些？
定氮法、双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法）。

凯氏定氮灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为±2％，费时8～10小时，将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定。

非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定，干扰少，费时太长。

双缩脲法（Biuret法）灵敏度低1～20mg 中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似
紫外吸收法较为灵敏50～100mg 快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；
Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高～5mg 慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；
各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；
9．测定蛋白质分子量的方法？
SDS-PAGE 超速离心凝胶过滤粘度法生物质谱技术
10．常用的蛋白质染色方法及优缺点？
常用的染色方法主要是考马斯亮蓝法、银染法、荧光染色法和负染法。

最普遍的染色方法是考马斯亮蓝法，因为便宜而且操作简单。

而银染法比考马斯亮蓝法灵敏度要高，但银染
法会影响到质谱检测，而且银染法比考马斯亮蓝法步骤要复杂。

效果最好的是荧光染色法，荧光染色法灵敏度高且不会影响到质谱检测。

11．分光光度计的原理？
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。

样品的吸光值与样品的浓度成正比。

12．过氧化物酶与过氧化氢酶作用机制有什么不同？
过氧化氢酶存在于过氧化物酶体中，可对细胞起保护作用，使细胞免受过氧化氢的危害。

过氧化氢酶是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。

过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶,，约占过氧化物酶体酶总量的 40%。

过氧化氢酶存在于所有已知动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。

过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。

过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。

13．为什么要用双倒数作图法来求米氏常数？
如上左图所示，底物浓度曲线是矩形双曲线，其图形为渐近线，很难准确地测得Km 值和Vmax 值；
若将米氏方程进行如上右图所示的变换，将曲线改为直线作图，便可容易地用图解法准确求得Km 值和Vmax 值。

七、注意事项
1. 取雄鼠肝脏时，尽量把肝脏取尽，避免取肝脏以外的组织。

2. 使用离心机要注意平衡、平稳、对称、牢固、缓慢、以防止损伤离心机。

3. 手动玻璃匀浆器助溶时，要注意缓慢旋转推移，时间稍微长一些，使溶解的更充分。

4. 使用分光光度计前，要记得调零。

5. 每次离心试验后，不要晃动，避免有少量沉淀溶解，对实验结果造成影响。

6. 装柱时，避免出现断层、干胶。

V
1
Km 1 max
1V max
V Km
斜率=
0 ][1S
双倒数作图法 初
速度
V V max
21
Vmax
Km 底物浓度[S] 矩形双曲线作图法
7. 层析时，加样品和缓冲液时要旋转加入，并及时补充缓冲液，要避免干胶。

8. 加样时，要加在加样口里，不要加到样品槽外。

9. 拔样品槽模板（梳子）时要小心，注意不要破坏胶。

八、结果误差分析
本次实验结果与理论数值基本符合，但稍有误差，
可能因为：
a) 使用的仪器内有杂质，仪器老化
b) 滴加的试剂与酶没有充分接触
c) 酶因为操作时温度稍高部分会失活
d) 拿出离心管时稍微晃动使沉淀与上清液混合
e) 层析时收集的液滴大小不均造成吸光度测量误差
f) 滴定时计时不准确，滴定终点人为判断不一致
g) 滴定前过氧化氢分解或稍被硫酸污染
h) 周围环境中的杂蛋白影响
i) 可能因为实验时间过长造成酶活性降低
九、结语
过氧化氢酶制备与测定，据文献资料，目前商品化过氧化氢酶多以家畜家禽的血液、肝脏为原料，利用离子交换、凝胶层、纤维固定化等技术制备，但是操作多杂、成本极高（8000 元/kg）,且酶活性回收率极低（约30%左右）故不适合实验室的一般使用。

本次实验以小鼠肝脏为原料，采用实验室常用的盐析，透析，离心等简单技术，即可获得少量纯度较高，回收率高的过氧化氢酶，成本相对低廉，是实验室的理想选择。

纯化的过氧化氢酶可用于本校即河北医科大学制备过氧化氢酶抗体，具有极高的经济和社会价值。

通过该系列实验，对酶作为生物催化剂的特点有了进一步的认识。

具体表现在：
⑴高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快。

⑵专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽。

⑶多样性：酶的种类很多，大约有4000 多种。

⑷温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。

⑸活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。

⑹有些酶的催化性与辅助因子有关。

⑺易变性：由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。

十、致谢
感谢
感谢王翔、董浩同学对处理SDS-PAGE法测分子量数据的帮助；
感谢上海瑞齐生物科技有限公司提供的关于过氧化氢酶的资料；
感谢"Google学术" 对本实验的学术指导；
感谢"百度百科" 对本实验报告的大力支持。