实验九微生物菌体大小及菌群数量的测定

实验九微生物菌体大小及菌群数量的测定
生科15.2 周罡 201500181104
【实验目的】
1. 学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。

2. 学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。

【实验原理】
（一）微生物菌体大小的测定
微生物大小的测定，需借助于特殊的测量工具——显微测微尺，它包括目镜测微尺和镜台测微尺两个互相配合使用的部件。

镜台测微尺（图1）是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每一小格长度为0.01mm，即10μm。

刻线外有一直径为Φ3，线粗为0.1mm的圆，以便调焦时寻找线条。

刻线上还覆盖有厚度为0.17mm的盖玻片，可保护刻线久用而不损伤。

镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。

图1 镜台测微尺图2 目镜测微尺
目镜测微尺（图2）是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般优彼等分为50小格和100小格两种。

测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。

由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。

因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的长度。

然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。

（二）显微镜计数
显微技术法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有特定容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接观察、计数的方法。

目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们可用于各种微生物单细胞（孢子）悬液的计数，基本原理相同。

其中血细胞计数板较厚，不能使用油镜，常用于个体相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数，而后两种计数器较薄，可用油镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

除了用上述这些计菌器外，还有用已知颗粒浓度的样品如血液未知浓度的微生物细胞（孢子）样品混合后根据比例推算后者浓度的比例计数法。

显微技术法的优点是直观、快速、操作简单，缺点则是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对运动性强的活菌进行计数。

目前已有一些方法可以克服这些缺点，如结合活菌染色、微室培
养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计活菌体的目的，或用染色处理等杀死细胞以计数运动性细菌等。

本实验以最常用的血细胞计数板为例对显微计数法的具体操作方法进行介绍。

血细胞计数板是一块特制的厚载玻片，其上有4条槽而构成3个平台。

中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网。

每个方格网共分为9个大方格，中间的大方即为格计数室。

血细胞计数板构造如图3所示。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是大方格分为25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16中方格，而每个中方格又分成25个小方格(图4)。

但无论是哪一种规格的计数板，每个大方格都由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（10-4mL）。

计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每格中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液的总菌数。

以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：
图3 血球计数扳的构造
a. 平面图(中间平台分为两半，各半边有一个方格网)
b. 侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙)
图4 血球计数板计数网的分区和分格
【实验器材】
1. 菌种
枯草芽孢杆菌，酵母菌
2. 溶液和试剂
结晶紫，香柏油，二甲苯
3. 仪器和其他用品
目镜测微尺，镜台测微尺，血细胞计数板，普通光学显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），载玻片，盖玻片，酒精灯，接种环，擦镜纸，滴管和蒸馏水
【实验步骤】
（一）微生物菌体大小的测定
1. 目镜测微尺的安装
把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。

旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

2. 校正目镜测微尺
将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。

先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行。

利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。

用同样方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。

由于镜台测微尺每格长10μm，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

3. 菌体大小的测定
将枯草芽孢杆菌进行简单染色制片，酵母菌制成水浸片。

目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上菌制片。

先用低倍镜和高倍镜找到标本后，换油镜测定酵母菌的直径和枯草芽孢杆菌的长度和宽度。

测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出细菌直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。

最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。

（酵母菌细胞较大，未用油镜也可观察）
每种菌选择3个细胞进行测量。

对于长度不足一格的情况，小数点后一位作为估读。

4. 测定完毕
测定完毕后取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。

（二）菌群数量的测定
1. 准备
取一血细胞计数板洗净，待其自然干燥。

2. 加样品
在洁净干燥的血细胞计数板的计数室上盖上一块盖玻片。

将酵母菌菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台一侧的沟槽内沿盖玻片的右上角缓慢滴入，使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行渗入计数室，至另一侧沟槽内有菌液渗入，注意勿使产生气泡。

3. 显微镜计数
将加有样品的血细胞计数板置于显微镜载物台上，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。

若发现菌液太浓，进行稀释后再次计数，一般样品稀释要求为每小格内细菌不超过10个，酵母菌不超过5个。

在计数室中选择5个中方格（四角和中央）中的菌体进行计数，对于位于格线上的菌体，遵循“计上不计下，计左不计右”的原则。

4. 清洗
使用完毕后，将血细胞计数板清洗、干燥【实验结果】
1. 目镜测微尺校正结果
表1 目镜测微尺校正结果
2. 枯草芽孢杆菌大小测定结果
表2枯草芽孢杆菌大小测定结果（油镜）
3. 酵母菌大小测定结果
表3 酵母菌大小测定结果（高倍镜）
4. 血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果
表4 显微计数结果
其中，A表示5个中方格中的总菌数，B表示液稀释倍数。