生防菌株SY286对葡萄霜霉病菌的抑菌效果

生防菌株SY286对葡萄霜霉病菌的抑菌效果
臧超群;赵奎华;刘长远;梁春浩;刘丽;于舒怡
【摘要】研究了生防细菌SY286菌株对葡萄霜霉病菌的抑菌效果,试验结果表明:SY286菌株在代谢过程中能够产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素等抑菌代谢产物;SY286的发酵液成分可导致葡萄霜霉病菌菌丝及孢子囊出现皱缩、破裂等现象;SY286振荡培养3d,抑菌效果最大,达93.18％;60％的硫酸铵饱和度下提取的抑菌粗提蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌效果最好,抑菌效果可达76.30％.
【期刊名称】《沈阳农业大学学报》
【年(卷),期】2014(045)002
【总页数】4页(P221-224)
【关键词】SY286菌株;葡萄霜霉病菌;代谢产物;胞外蛋白;抑菌效果
【作者】臧超群;赵奎华;刘长远;梁春浩;刘丽;于舒怡
【作者单位】沈阳农业大学植物保护学院,沈阳110161;辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161;辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161;辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161;辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161;辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161;辽宁省农业科学院植物保护研究所,沈阳110161
【正文语种】中文
【中图分类】S476.1
目前,全世界葡萄栽培面积已超过1×107hm2,年产量近6×107t,成为仅次于柑橘的世界第2大果树作物[1]。

葡萄霜霉病是由葡萄生单轴霉[Plasmopara viticola （Berk.et Curtis）Berl.et de Toni]引起的一种世界性病害,是葡萄生产中为害最大的病害之一。

该病害的发生可造成叶片焦枯早落,新梢生长不良,果实产量降低,品质变劣,植株抗寒性差[2]。

目前,该病害主要使用化学药剂进行防治,化学农药虽然具有毒力强、见效快等特点,但长期连续使用,会带来环境污染、农药残留和病原菌的抗药性等诸多问题[3]。

因此,植物病害生物防治的研究越来越受到重视。

SY286菌株是本实验室筛选获得的葡萄霜霉病菌生防菌株,经鉴定其为苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）。

目前,对苍白杆菌的研究主要集中在石油降解[4]、染料脱色[5]、有机磷农药降解[6]等方面,在防治植物病害方面研究较少。

本试验主要进行了SY286菌株代谢产物对葡萄霜霉病菌抑制效果的研究,并通过显微观察技术研究了菌株SY286对葡萄霜霉病菌的菌丝及孢子囊的影响,并对SY286菌株产生的抑菌代谢产物进行初步分析,为进一步阐明SY286菌株的抑菌机制提供理论依据。

1.1 材料
供试SY286菌株,由辽宁省农科院植保所园艺病害研究室保存。

供试葡萄霜霉病菌,分离自无核白鸡心感病葡萄叶片上,并接种于健康无核白鸡心叶片上保存。

供试NA培养基为:牛肉膏3g,酵母膏1g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH值7.2。

纤维素培养基为:蛋白胨10g,酵母粉10g,CMC-Na 10g,NaCl 5g,KH2PO41g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH值7.0。

蛋白培养基为:脱脂奶粉
40g,琼脂15g,水400mL。

嗜铁素培养基:酪天青S 0.5mg,10mL 3价铁溶液
（1mLFeCl3·6H2O,用10mmol·L-1盐酸定容至10mL）,HDTMA72.9mg,琼脂15g,定容至1000mL,pH值7.0。

1.2 方法
1.2.1 SY286菌株拮抗代谢产物的分析将培养36h的SY286菌株点接到纤维素培
养基上[7],27℃培养3d,用1mg·mL-1的刚果红染色1h,倒掉刚果红,用1mol·L-1氯化钠溶液浸泡1h,观察有无透明圈；将培养36h的SY286菌株穿刺移植到嗜铁素培养基上[8],27℃培养8d,观察颜色变化；将培养36h的SY286菌株穿刺移植到蛋白培养基上[9],28℃培养3d,观察有无透明圈产生。

1.2.2 不同发酵时间对SY286菌株发酵液抑菌效果的影响用接种环挑取单菌落,接入盛有100mL NA培养液的250mL三角瓶中,27℃恒温振荡培养,转速150r·min-1,培养时间48h,作为母液。

吸取1mL母液,接种到盛有100mL NA培养液的250mL三角瓶中,27℃,150 r·min-1恒温摇床中振荡培养1,2,3,4,5,6,7d备用,每个处理3次重复。

采用叶片病斑抑制法测定不同发酵时间对SY286菌株发酵液抑菌效果的影响。

采集叶龄及叶片大小一致的健康葡萄叶片,用无菌水将其冲洗干净,用脱脂棉包住叶柄,背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中。

将配制好的葡萄霜霉病菌孢子囊悬浮液（105个·mL-1）喷布于叶片背面,24h后喷布不同发酵时间的SY286发酵液,用封口膜密封。

置于光暗（12h/12h）交替,22℃下培养,7d后观察抑菌效果。

每个处理5片叶片,4次重复。

病害调查分级标准[10]:0级,无病斑；1级,病斑面积占整个叶片面积的5%以下；3级,病斑面积占整个叶片面积的6%～25%；5级,病斑面积占整个叶片面积的26%～50%；7级,病斑面积占整个叶片面积的51%～75%；9级,病斑面积占整个叶片面积的76%以上。

抑菌效果通过病情指数计算。

1.2.3 SY286发酵液对葡萄霜霉病菌菌丝及孢子囊的影响将葡萄叶片用无菌水冲洗干净,背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中,叶柄包上润湿的脱脂棉。

将葡萄霜霉病菌孢子囊（1×105个·mL-1）菌悬液喷布于叶片背面,用封口膜密封,置于光暗（12h/12h）交替,22℃下培养,待出现霜状霉层时,将发酵培养3d的SY286菌株发酵液20μL点接在葡萄霜霉病霜状霉层上,6h后在点接边缘处切取4mm×4mm
叶块,并以2%戊二醛固定4h,生理盐水冲洗3次,经乙醇梯度脱水后,干燥、粘样、离子溅射仪镀膜。

以未接SY286菌株发酵液霜霉病菌为对照,扫描电镜观察菌丝及孢子囊形态。

1.2.4 SY286菌株胞外蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌作用将上述振荡培养3d的发酵液12000r·min-1,4℃离心30min去除菌体,上清液经细菌滤器（Φ=0.22μm）过滤,获得无菌滤液。

将无菌滤液用不同饱和度的硫酸铵
（10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%）分级沉淀,4℃静置过夜
后,12000r·min-1离心30min弃上清液,收集沉淀蛋白用少量体积的0.01mol·L-1的磷酸缓冲液(pH值7.2)溶解,装入透析袋中,用双蒸水透析去盐并用聚乙二醇6000包埋浓缩后即得到抑菌蛋白粗品,然后在离体叶片上测定其对葡萄霜霉病菌的抑菌效果,每个处理4次重复,计算方法同1.2.2。

试验所得数据结果采用SPSS18.0软件进行组件均值数据的One-Way ANOVA （p=0.05）差异显著性分析。

2.1 SY286菌株代谢抑菌产物的分析
在纤维素培养基上,SY286菌落周围有透明圈产生,说明其代谢产物中含有分解纤维素的纤维素酶；在嗜铁素培养基上,SY286菌落周围有透明圈产生,说明其代谢产物中含有嗜铁素；在蛋白酶培养基上,SY286菌落周围的蛋白质被水解,出现透明圈,说明其生长过程中产生蛋白酶（图1）。

因此,SY286菌株具有分解纤维素、蛋白质和结合Fe3+的能力。

可见该菌的代谢产物中能产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素。

2.2 不同发酵时间对SY286菌株发酵液抑菌效果的影响
由图2可知,随发酵时间延长,SY286发酵液对葡萄霜霉病菌的抑菌效果逐渐升高。

发酵1d时SY286菌株发酵液对葡萄霜霉病菌的抑菌效果为67.04%,发酵3d的抑菌效果最大,达93.18%,与经其他发酵时间获得的SY286发酵液对葡萄霜霉病菌的抑菌效果差异显著（p=0.05）。

之后,SY286菌株发酵液对葡萄霜霉病菌的抑菌效
果趋于稳定。

因此,后续试验选择3d作为发酵时间。

2.3 SY286发酵液对葡萄霜霉病菌菌丝及孢子囊的影响
由图3可知,对照葡萄霜霉病菌菌丝及孢子囊形态饱满,细胞壁光滑,分支正常,而用SY286发酵液处理6h后,病菌菌丝和孢子囊形态与对照相比发生很大变化,菌丝出
现干瘪、褶皱,有些菌丝出现破碎,孢子囊也出现皱缩、破裂现象。

2.4 SY286菌株胞外蛋白对葡萄霜霉病菌的抑制作用
由表1可知,经60%饱和硫酸铵沉淀后的粗提蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌效果最强,此时沉淀蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌效果显著高于其他处理,抑菌效果可达76.30%；SY286无菌发酵滤液经10%饱和硫酸铵沉淀析出的蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌效
果最差,仅为9.30%。

从葡萄叶片上分离得到的苍白杆菌SY286,对葡萄霜霉病具有较好防治效果。

关于
生防细菌的抗生作用,主要是通过分泌一种或多种抑菌物质直接抑制或杀死病原菌,
这些抑菌物质包括酶类、抗生素、细菌素以及具有抗菌作用的有机酸、氨类等初始代谢途径中的副产品等等[11]。

该菌在代谢过程中能够产生纤维素酶、嗜铁素以及蛋白酶等成分[12-13],这些成分可能与试验中其对病菌的抑制作用存在一定程度的关联,前人也曾有类似报道[8,14]。

葡萄霜霉病菌是卵菌纲（Oomycetes）、单轴
霉属（Plasmopara）,其细胞壁主要成分是纤维素,细胞壁是保护植物病原真菌最
重要的屏障,有些细菌在代谢过程中能分泌纤维素酶、蛋白酶等细胞壁降解酶降解
病原菌细胞壁,不仅抑制了病原菌,而且还为自身生长提供了碳源[15]。

试验中显微
观察到菌丝及孢子囊有破裂现象,可能是由纤维素酶、蛋白酶等细胞壁降解酶所致。

60%饱和度硫酸铵沉淀出的粗提蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌效果最大,达81.98%。

有研究表明,硫酸铵浓度达60%时能沉淀出大部分抑菌蛋白[16-17]。

安霞[18]研究证实,苍白杆菌H10发酵液经60%饱和硫酸铵沉淀对西瓜枯萎病菌和黄瓜枯萎病菌具有明显抑制作用,并检测到较高的蛋白酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力。

生
防细菌对病原菌的抑菌作用表现在多个方面,其抑菌机制也不尽相同,通过试验证明SY286菌株对葡萄霜霉病菌具有较强抑菌作用,并对其抑菌代谢产物进行初步分析,有望使其在葡萄霜霉病的生物防治中发挥更大潜能。

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