敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖

敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖袁白银;胡继盛;刘钟颖;黄霞
【摘要】细胞骨架肌动蛋白在细胞增殖、迁移等生物学过程中发挥重要作用,然而WDR1 作为肌动蛋白解聚的主要辅助因子,其在平滑肌细胞中的作用尚无报道.构建Wdr1 条件性诱导敲除小鼠模型,进而分离小鼠原代主动脉平滑肌细胞,诱导敲除Wdr1,检测平滑肌细胞的形态、增殖和迁移情况.PCR 结果显示,Wdr1f/f;ERT2Cre 小鼠模型构建成功.免疫荧光结果表明:在前人基础上改进的分离方法能够高效分离原代平滑肌细胞.细胞形态观察结果显示:Wdr1 敲除后对细胞的形态有显著性影响.同时,划痕实验以及 CCK8 检测结果也表明:Wdr1 的条件性诱导性敲除可明显抑制平滑肌细胞的迁移和增殖.Wdr1 敲除后平滑肌细胞的形态以及细胞生物学过程的改变提示其与血管疾病的发生和发展有紧密联系,这对揭示血管病理生理过程有重要意义.
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2018(034)012
【总页数】7页(P179-185)
【关键词】条件性诱导敲除小鼠;WDR1;平滑肌细胞;增殖;迁移
【作者】袁白银;胡继盛;刘钟颖;黄霞
【作者单位】武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065
【正文语种】中文
尽管心血管疾病的预防、诊断和治疗方面取得了重大进展，但其仍为全球范围内主要的死亡原因［1］。

动脉粥样硬化是动脉粥样斑块积聚引起的以动脉管腔狭窄为主要特征的一类疾病，是大多数心血管疾病的表现并可导致心肌梗塞或中风［2］。

平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）构成了血管的主要细胞组成，也是血管病理过程的重要参与者，在动脉粥样硬化过程中伴随着平滑肌细胞的增殖、迁移等过程，且平滑肌细胞和巨噬细胞会吞噬脂质进而变成泡沫细胞［3］。

有研究表明血管平滑肌细胞的增殖和迁移是内膜增生的关键［4］，内膜增生是导致动脉硬化［5］、血管成形术后再狭窄等病理生理过程的重要因素。

在正常情况下，VSMCs 在动脉中膜保持非增殖状态；在受伤或其他刺激作用下，例如缺氧等，中层 VSMCs 发生表型转换［6-7］，迁移至内膜［8-9］，开始增殖并分泌细胞
外基质，导致动脉内膜增生，血管腔狭窄，即新内膜形成［4］，并进一步导致严重的心血管疾病，如高血压，缺血性疾病和随后的心肌梗塞、中风和充血性心力衰竭［10-11］。

这些病理生理过程都表明，平滑肌细胞对心血管疾病的发生发展都有着重要作用。

因此，研究 VSMCs 增殖、迁移以及内膜形成的病理生理学特征和分子机制将对临床上心血管疾病的治疗有一定指导意义。

细胞的增殖、迁移等过程离不开细胞骨架的重构［12］，该过程主要涉及肌动蛋
白（Actin）解聚和加聚的动态平衡过程，在其解聚的过程中有众多的解聚因子参与，如 ADF/cofilin、WDR1 等；ADF/cofilin是 actin 切割和解聚的主要因子，
在肌动蛋白动力学（Actin dynamics）过程中起着至关重要的作用。

Wdr1是果
蝇中AIP1（肌动蛋白相互作用蛋白1）的哺乳动物同系物，位于人4号染色体上，是 ADF/cofilin的主要辅助因子［13］；WDR1 能促进 ADF/cofilin 介导的对肌
动蛋白丝（F-actin）的解聚作用［14-15］，从而调控细胞内 actin 解聚和加聚的
平衡［16］。

WDR1调控的actin dynamics直接影响细胞迁移、细胞连接［17］、细胞增殖等生物学过程［16］。

有报道表明在乳腺癌中 Wdr1 的高表达能够促进癌细胞的迁移以及增殖［18-19］。

我们之前的研究发现：Wdr1 的缺失严重影响肺癌细胞的增殖与迁移（未发表数据）；在胚胎发育过程中，Wdr1 的缺失导致致死表型［20］。

然而，迄今为止 WDR1 在平滑肌细胞中的作用还未见报道。

平滑肌细胞迁移和增殖在血管内膜损伤修复过程中起重要作用，WDR1 介导的肌动蛋白解聚是细胞增殖和迁移所必需的。

基于以上两点，我们推测WDR1 可能在血管平滑肌细胞介导的血管损伤修复过程中发挥重要作用。

本研究拟利用条件性诱导敲除小鼠在主动脉血管平滑肌细胞中敲除 Wdr1，以研究 WDR1 对平滑肌细胞迁移和增殖的影响，为血管损伤修复的机制提供新的方向。

将带有 tamoxifen 诱导表达的 ERT2Cre 小鼠与 Wdr1f/f 小鼠［21］交配后得到 Wdr1 条件性诱导敲除小鼠，并分离出原代平滑肌细胞。

通过 tamoxifen 诱导得到敲除 Wdr1 的原代平滑肌细胞，研究结果表明 Wdr1 敲除后抑制平滑肌细胞的增殖和迁移能力。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 小鼠购自南京大学模式动物研究所。

所有的动物实验均经武汉科技大学动物伦理委员会批准，实验过程中对动物的处理均符合动物伦理学标准。

1.1.2 主要试剂鼠单抗肌动蛋白 SMA（abcam 公司，ab7817）；兔多抗 WDR1（proteintech，13676-1-AP）；DAPI 购自生工生物工程（上海）有限公司（6584）；羊抗鼠荧光二抗（488）购自武汉博士德生物工程有限公司
（BA1126）；0.1% 明胶（100 mL ddH2O 中加入 0.1 g 明胶，高压灭菌，冷却备用）；75% 乙醇（用 ddH2O 配制）；无菌 PBS ；4% 的多聚甲醛购自武汉博士德生物工程有限公司（AR1068）；4-羟基他莫昔芬（Sigma，H7904）。

1.1.3 培养基高糖 DMEM 细胞培养基，使用高糖DMEM 干粉（GIBCO）配制，加入 800 mL 超纯水，加入碳酸氢钠 3.7 g，HEPES（Sigma）
2.383 g，调节pH 至 7.4，并定容至 1 L，0.22 μm 滤膜过滤除菌。

使用时加入 10% 的胎牛血清（FBS，hyclone），100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素。

1.1.4 细胞分离消化液Ⅱ型胶原酶（Invitrogen）溶于 DMEM 高糖培养基，使其浓度为 1 mg/mL（含10%胎牛血清和双抗），0.22 μm 滤器过滤除菌即用。

1.1.5 小鼠基因组提取液及引物小鼠组织裂解液配置如表 1，使用时按照300 μL
裂解液中加入5 μL浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K。

基因型鉴定引物见表 2。

表1 小鼠组织裂解液试剂名称体积/mL Tris（pH 8.0，1 mol/L） 10 mL NaCl （4 mol/L） 100 mL EDTA（0.5 mol/L） 4 mL 10%SDS 100 mL H2O 补足到
1L
表2 基因型鉴定引物引物名称引物序列（5′-3′）Wdr1 FloxP分型引物序列
Wdr1 FloxP（F） GCTATAAATGAGGTCCTGATGAG Wdr1 FloxP（R）TCAGGCTTACAAAGCTCACATG Cre酶鉴定引物Cre forward AATGCTTCTGTCCGTTTGC Cre reverse ACCAGAGTCATCCTTAGCG
1.2 方法
1.2.1 Wdr1条件性诱导敲除小鼠的构建 ERT2Cre小鼠与 Wdr1f/f 小鼠交配得到
的子代基因型为Wdr1f/+；ERT2Cre 杂合子小鼠，回交得到纯合子小鼠Wdr1f/f；ERT2Cre。

1.2.2 基因型鉴定在小鼠出生后 7 d，剪小鼠脚趾编号，用小鼠组织裂解液消化剪掉的脚趾（每个样品加入300 μL 裂解液以及5 μL 浓度为 20 mg/mL的蛋白酶K），放在55℃ 水浴锅中过夜，第2天加入700 μL 的无水乙醇，12 000 r/min 离心 2 min，去掉上清加入600 μL 的 70% 的乙醇重悬沉淀，12 000 r/min 离心2 min 后弃掉乙醇加200 μL 的无菌水溶解沉淀。

通过 Wdr1 Flox 特异性引物以
及 Cre 特异性引物以提取的基因组为模板做 PCR，基因型鉴定结果确定回交后代
基因型为Wdr1f/f；ERT2Cre，即 Wdr1条件性诱导敲除小鼠构建成功。

1.2.3 血管平滑肌的分离取4-8 周条件性诱导敲除小鼠，颈椎脱臼处死后，置于75% 乙醇中浸泡 1 min，打开胸腔和腹腔，用 5 mL 注射器穿刺左心室，PBS 缓
冲液冲洗主动脉，游离并且完整分离出主动脉；在 35 mm 平皿中加入 2 mL PBS，将分离出的主动脉放入皿中，在解剖镜下剥离主动脉上附着的脂肪等组织，将血管转移到另一个 35 mm 平皿中，加入 2 mL 消化液，在培养箱中消化 10 min；加
入 2 mL 正常的 DMEM 高糖培养基终止消化，在解剖镜下剥离主动脉外膜，消化后外膜更好剥离；将处理好的血管转移到另一干净的 35 mm 平皿，迅速用眼科剪剪成 1 mm3 大小的块状，加入消化液消化 2 h，期间用 0.1% 的明胶包被 35
mm 平皿1 h，弃掉明胶在操作台中自然风干；消化期间每隔 0.5 h 观察一下小块，并且用枪稍加吹打，约2 h 后小块基本消化完全，加入等体积的 DMEM 培养基终止消化，1 000 r/min 离心 5 min，弃掉上清，用 1 mL 正常 DMEM培养基重悬，将悬液接种于 35 mm 包被过的平皿，补足培养基到 4 mL，静止培养 3 d，按照
2 条血管一个平皿，
3 d 可以长满，这时细胞可以正常传代。

1.2.4 免疫荧光鉴定分离细胞将干净盖玻片放入12 孔板，包被方法同前。

0.25% 胰酶消化，将细胞接种到附有盖玻片的 12 孔板中，第2天待细胞伸展后，弃掉培养基，用 PBS 清洗 5 min，加入 1 mL 4%多聚甲醛室温固定 20 min，弃掉多聚
甲醛，加 PBS洗 3 次，每次 5 min；加入 PBST（0.2% Triton X-100 in PBS）1 mL 室温通透 5 min，加 PBS 洗 3 次，每次5 min；用 5% 的山羊血清室温封闭
1 h；用 5% 的山羊血清稀释α-SMA（1 ：200）4℃ 孵育过夜。

用 PBS清洗 3 次，每次 5 min；用 PBS 稀释 DAPI（1mg/mL，1∶1 000）和羊抗鼠荧光二抗（1∶200）室温孵育
2 h（避光），用 PBS 清洗
3 次，每次 5 min，50% 甘油封片，激光共聚焦显微镜观察。

1.2.5 平滑肌中Wdr1的诱导敲除将分离的 SMCs接种于6 孔板，正常培养1 d，待细胞密度接近于80% 时，实验组加入 4-羟基他莫昔芬（10 mmol/L）按照
1∶10 000 与培养基混合加入6孔板，对照组加入相同体积的 DMSO 作为对照；混合培养 2 d；每天都换含有 4-羟基他莫昔芬的新鲜培养基。

1.2.6 Western blotting 检测敲除效率取6孔板中收集的细胞提取蛋白，上样量
为60 μg，经 10% 分离胶分离，采用 PVDF 膜转膜，5% 脱脂牛奶室温封闭 1 h；一抗 WDRl 抗体（1∶1 000 稀释液稀释），4℃孵育过夜；二抗 HRP 标记的羊抗兔 IgG（1∶5 000，5%脱脂牛奶稀释）室温孵育 1 h。

用 ECL 显色试剂对膜进行显色，通过显影成像分析系统（Biorad）对条带进行显影、成像和保存，分析以GAPDH（1∶3 000，5% 脱脂牛奶稀释）蛋白表达作为参照，应用 ImageJ软件
对条带进行定量分析。

测定目的显影条带和内参照 GAPDH 的灰度值，结果以比
值（目的条带灰度值/内参照条带灰度值）表示。

1.2.7 细胞划痕实验取原代诱导 2 d 的细胞接种于 6 孔板，接种密度为1×106 个/孔，24 h后用200 μL 的无菌枪头垂直于 6 孔板底水平画出直线，确保画出的直线宽度一致。

用无菌 PBS 清洗细胞 3次，换新鲜培养基培养，分别于 0 h、12 h、24 h 对同一位置进行观察拍照。

计算划痕的面积，结果以12 h、24 h 面积/相对
应 0 h 面积来表示。

1.2.8 CCK8检测增殖取诱导的原代细胞按照1×103个/孔接种 96 孔板，每组 4 个复孔，在接种细胞的孔周围每孔补上100 μL 的无菌 PBS；12 h 后加入10 μL
的 CCK8 溶液，在37℃ 培养箱培养 1 h，通过多功能酶标仪检测 OD450 处的吸光值，每隔 24 h测一次，连续测 3 d，绘制细胞增殖曲线。

1.2.9 统计学分析统计学分析采用不对称双边t检验，数据采用x-±s来表示，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果
2.1 成功构建出Wdr1f/f；ERT2Cre小鼠模型
将构建的 Wdr1f/f雌性小鼠与 ERT2Cre 雄性小鼠交配得到基因型为Wdr1f/+；ERT2Cre 小鼠；将基因型为 Wdr1f/+；ERT2Cre 雄性小鼠与 Wdr1f/f 雌性小鼠交配（图1），得到基因型为 Wdr1f/f；ERT2Cre 的小鼠（图 2）。

图1 Wdr1f/f；ERT2Cre小鼠构建策略
图2 小鼠基因型鉴定
2.2 主动脉平滑肌细胞的高效分离
取 4-8 周龄小鼠的主动脉分离出的 SMCs 经过 3 d 静置培养后能够铺满 35 mm 皿底。

将分离的 SMCs接种于含有载玻片的培养皿中，通过免疫荧光实验检测分离的 SMCs。

结果（图3）显示，分离的平滑肌标志性marker α-SMA都呈现阳性信号，说明该分离方法能够得到高纯度的平滑肌细胞。

图3 免疫荧光鉴定分离的SMCs
2.3 在分离的SMCs中成功诱导敲除Wdr1
为了在分离的 SMCs 中敲除 Wdr1，将分别由基因型为 Wdr1f/f；ERT2Cre 和Wdr1f/f 的小鼠中分离的SMCs，接种于 6 孔板，待细胞密度达到 80%，加入4-羟基他莫昔芬诱导 2 d 后，提取蛋白进行 Western blotting 检测 WDR1 的表达水平。

结果（图4）表明，和 Wdr1f/f 对照组 SMCs 相比，Wdr1f/f；ERT2Cre 实验组 SMCs 中 WDR1 的表达水平显著下降。

图4 Western blotting检测Wdr1敲除效率A：4-羟基他莫昔芬诱导后，Western blotting检测 SMC 中 WDR1 的表达水平。

B：统计结果表明：4-羟基他莫昔芬诱导后，在Wdr1f/f；ERT2Cre 组SMC中WDR1 水平显著下调，*** P ＜0.001
2.4 敲除Wdr1后，SMCs形态发生明显改变
WDR1 是 ADF/cofilin 的主要辅助因子，ADF/cofilin 是介导肌动蛋白解聚的主要
因子，肌动蛋白是细胞骨架构成的关键，因此我们推测 Wdr1 敲除后将会对细胞
形态有影响。

为了验证这个设想，将分离的 SMCs 接种于 6 孔板中，经 4-羟基他莫昔芬诱导敲除 Wdr1 后，显微镜下观察细胞形态。

形态及统计结果（图5）显示，和对照组细胞相比，敲除Wdr1 后 SMCs 形态有明显的改变，细胞变小、变圆。

图5 4-羟基他莫昔芬诱导后的细胞形态A：箭头显示基因型为 Wdr1f/f；
ERT2Cre 的实验组细胞诱导敲除 Wdr1 后细胞形态发生显著性改变；B/C：统计
结果显示，实验组Wdr1f/f；ERT2Cre 细胞横截面积以及长宽比均小于对照组Wdr1f/f
2.5 SMCs中敲除Wdr1，细胞迁移和增殖能力被抑制
细胞的增殖、迁移等过程离不开细胞骨架的重构，该过程主要涉及肌动蛋白（Actin）解聚和加聚的动态平衡过程，在其解聚的过程中有众多的解聚因子参与，其中包括 WDR1。

为了进一步研究WDR1 对平滑肌细胞生物学功能的影响，分别通过划痕实验和CCK8实验进行细胞迁移和增殖能力的检测。

结果（图6）显示，Wdr1 敲除组细胞的迁移能力明显弱于对照组；Wdr1敲除组细胞的增殖能力也明显减弱（图7）。

图6 划痕实验检测细胞迁移能力A：划痕-伤口愈合实验检测 Wdr1 敲除后迁移能力的变化；B：统计结果显示，与对照组相比实验组敲除 Wdr1 后，细胞迁移能
力明显受到抑制。

*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001
图7 CCK8实验检测细胞增殖能力细胞增殖实验检测 Wdr1 敲除后的增殖能力，
与对照组相比，实验组敲除Wdr1 后增殖能力明显受到抑制。

*：P＜0.05；**：P ＜0.01；***：P＜0.001
3 讨论
平滑肌细胞的分离一直都是研究其功能的基础，我们在前人的基础上改进方法
［22］，在主动脉取出后通过胶原酶消化 10 min 使得外膜更好剥离，能够较好
保证动脉的完整性，在剪块的操作过程中更方便，该方法在较短的时间内能大量的获得高纯度的平滑肌细胞，能满足后续的实验。

平滑肌细胞的标志物有多种，α-SMA 是最为广泛使用的一种，还有SM22α［23-24］、SM-MHC［25］、calponin 等［26-27］，这些标志物不仅可以用来显示分离平滑肌的纯度，还可
以用来指示平滑肌细胞的分化程度。

有研究表明，成纤维细胞在一定条件下去分化形成肌成纤维细胞也可表达α-SMA［28］，因此本实验仅用 SMA 验证分离细胞的纯度有一定的局限性。

为研究 WDR1 在平滑肌中的作用，我们将Wdr1f/f 小鼠［21］与 ERT2Cre 小鼠交配，并成功繁育出Wdr1 条件性诱导敲除小鼠模型 Wdr1f/f；ERT2Cre；将条
件性敲除模型和动脉平滑肌细胞分离相结合，成功分离出大量的条件性敲除平滑肌细胞。

结合体外4-羟基他莫昔芬诱导［29］，在分离的平滑肌细胞中敲除Wdr1。

敲除 Wdr1 后细胞形态发生明显改变，细胞增殖和细胞迁移能力被明显抑制，该
结果与在乳腺癌细胞中报道的敲除WDR1影响癌细胞的迁移和增殖结果一致［15］；但是 WDR1 在细胞增殖和迁移过程中的调控机制还有待进一步的研究。

本研究构建的 Wdr1 条件性诱导敲除模型也为在体内研究WDR1 对平滑肌细胞的影响提供了良好的模型基础。

有文章报道［30］小鼠颈动脉结扎可诱导血管损伤
以及内膜形成；后续的研究将根据该模型在 Wdr1 条件性诱导敲除小鼠的基础上
构建内膜损伤修复模型，在体内研究 WDR1 对血管内膜形成的影响。

总之，本研究利用条件性敲除小鼠为工具，分离出 SMCs 并且体外诱导 Wdr1 的
敲除，从细胞的功能及形态上研究了 WDR1 对平滑肌细胞的影响，这为后续血管损伤修复机制的研究提供了一定的基础。

至于 WDR1 在分子水平如何调控平滑肌细胞的迁移和增殖，这将是我们后续研究的方向。

4 结论
本研究通过构建 Wdr1 条件性诱导敲除小鼠以及 SMCs 的分离，成功分离并诱导出 Wdr1 敲除的原代血管平滑肌细胞。

敲除 Wdr1 后，细胞的形态发生了明显的改变，并且细胞增殖和迁移受到显著抑制；该细胞模型和 Wdr1 条件性诱导敲除小鼠的构建对于研究 Wdr1 在平滑肌中的作用提供了有力的基础，为揭示血管损伤修复的病理机制提供了新方向。

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