色谱分析

3 分配色谱
分配色谱是利用各组分的分配系数不同而实现分 分配色谱是利用各组分的分配系数不同而实现分 离的ຫໍສະໝຸດ Baidu法。 离的方法。 分配系数： 分配系数：一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达 到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。 到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在层析 条件确定后分配系数是一常数。 条件确定后分配系数是一常数。
第二章 色谱分析
柱色谱 纸色谱、 纸色谱、薄层色谱 气相色谱 高效液相色谱
1 色谱法概论 1.1 色谱分析法的发展概况 (1)色谱法（chromatography）：是一种利用物质的 物理化学性质建立起来的分离、分析方法。广泛 用于复杂化合物的分离分析。 当流动相流过含有样品的固定相时，各组分 以不同的速度移动，从而达到分离。固定相可以 是固体，也可以是以被固体或凝胶所支持的液体 ，可以装入柱中，也可以展成薄层或涂成薄膜。 流动相可以是液体，也可以是气体。
洗脱和收集：原则上洗脱液应含有与交换 剂的亲和力较大的离子，以便把吸附在交 换剂上的样品离子交换下来。 梯度洗脱法：按一定规律变化的洗脱液进 行洗脱。浓度梯度，pH梯度。 再生：先经酸碱处理，然后再进行转型处 理。
5 凝胶色谱 5.1 原理 运动：垂直向下地移动和无定向地分子扩散 运动(布朗运动) 分子筛效应: 小分子物质自由进入网孔，线路长，移动慢，最 后流出。 大分子物质不进入网孔，线路短，移动快，最先 流出。 大小适中的物质，选择性地进入网孔，按分子大 小有序流出。 为了定量的衡量样品中各组分的流出顺序，常 用分配系数Ka来度量： Ka=（Ve－Vo)/Vi Ve 为洗脱体积，Vo为外体积，Vi为内体积
b 洗脱方法与洗脱曲线 溶剂洗脱法,置换法 置换法,前缘洗脱法 溶剂洗脱法 置换法 前缘洗脱法
溶剂洗脱法的洗脱曲线
置换法的洗脱曲线
前缘洗脱法的洗脱曲线
c 吸附剂和洗脱剂的选择 吸附剂的选择：是吸附层析的关键. 吸附剂的选择：是吸附层析的关键 分为无机(氧化铝 活性炭、硅胶、 氧化铝、 分为无机 氧化铝、活性炭、硅胶、碳 酸盐、碱土金属的氧化物、陶土、白土等) 酸盐、碱土金属的氧化物、陶土、白土等 和有机吸附剂(蔗糖 乳糖、淀粉、菊粉、 蔗糖、 和有机吸附剂 蔗糖、乳糖、淀粉、菊粉、 纤维素等)。 纤维素等 。 一般来说， 一般来说，非极性物质易被非极性表面 吸附，极性物质易被极性表面吸附， 吸附，极性物质易被极性表面吸附，溶液 中溶解度越大的溶质越难被吸附。 中溶解度越大的溶质越难被吸附。
色谱法的特点:选择性高；灵敏度高，样品用 色谱法的特点 量少；分离效率高，分离速度快；应用范 围广。 实质：分离 实质 目的： 目的 定性分析：出峰时间 定量分析：峰面积 纯度鉴定：出峰数量
（2）色谱法的由来：1906年由俄国植物学家 Tsweet创立。首先用于植物色素分离。 (3)色谱法的发展 30、40年代相继有了薄层色谱法和纸色谱法。 1938年德国生物化学家Kuhn因研究类胡萝卜素和 维生素获诺贝尔化学奖。 1942年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研 究获诺尔奖。 50年代英国生物化学家Martin在研究了液液分配 色谱的基础上建立了气相色谱法。James和Martin 提出了色谱分离的塔板理论，由于对气相色谱法 的贡献，他们获得1952年诺贝尔化学奖。 50年代后期出现了气相色谱-质谱联用技术。 60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色 谱，发展了高效液相色谱法。
4 离子交换柱层析 4.1 离子交换剂的选择与处理 离子交换剂组成:不溶性的三维空间网 状骨架＋活性基团＋可交换离子 不溶性母体的高分子物质：苯乙烯树脂， 酚醛树脂，纤维素，葡聚糖，琼脂糖或其 他聚合物。
引入不溶性母体的活性基团:酸性或碱性基 团 阳离子交换树脂：
阴离子交换树脂：
4.2离子交换柱层析操作 选择树脂――预处理 选择树脂 预处理――装柱定型 装柱定型―― 预处理 装柱定型 上柱――洗脱收集 洗脱收集――再生 上柱 洗脱收集 再生 装柱：交换剂必须在柱内分布均匀,严防有 气泡或裂缝产生.干法和湿法. 上柱:离子交换剂经转型成所需离子,需用溶 剂或缓冲液进行平衡.然后将样品液加进交 换柱.上柱时要注意样品的pH值、温度、离 子浓度和流速等.
5.2 凝胶地选择与处理 干胶溶涨(悬浮于5~10倍量的洗脱液中，常 温，热法/还可达到消毒灭菌和排除凝胶内气 泡的目的)，抽真空去气泡，配样品的溶液与 洗脱液要使用同一溶剂同一缓冲液。装柱，加 样与洗脱。 5.3 应用 a 蛋白质，酶，激素等大分子的分离纯化； b 蛋白质溶液脱盐，脱糖，脱脂； c 蛋白质，酶，激素等大分子的分子量测定。
分配色谱 利用各组分的分配 系数不同而实现分 离
原理
离子对离子交换树 分子筛效应 脂的亲和力,吸留 吸留/ Ka=(Ve-Vo)/Vi 脂的亲和力 吸留 洗脱交换
物质在两相间不断 进行分配,抽提作用 进行分配 抽提作用
操作
装柱―加样 选择树脂―预处理 样品处理―点样 点样(― 装柱 加样― 选择树脂 预处理 凝胶的选择与预处理 样品处理 点样 加样 ―装柱定型―上柱 ―装柱(柱平衡)―加样 平衡)―展开 ―装柱定型―上柱 ―装柱(柱平衡)―加样 平衡)―展开―显色 展开―显色 洗脱 装柱定型 装柱 柱平衡 ―洗脱收集 再生 与洗脱 保存 洗脱收集―再生 与洗脱―保存 ―定性定量分析 洗脱收集 定性定量分析 溶剂洗脱法/ 溶剂洗脱法 置换法/前缘 置换法 前缘 分析法 糖类/氨基酸 糖类 氨基酸/ 氨基酸 多肽/有机酸 有机酸/ 多肽 有机酸 色素/核苷酸 色素 核苷酸 维生素/抗 类/维生素 抗 维生素 生素等 置换(酸 碱 盐 置换 酸/碱/盐) 与凝胶溶涨及平衡所 用液体相同 蛋白质,酶 激素等大分 蛋白质 酶,激素等大分 子的分离纯化;蛋白质 子的分离纯化 蛋白质 溶液脱盐,脱糖 脱脂; 脱糖,脱脂 溶液脱盐 脱糖 脱脂 蛋白质,酶 激素等大分 蛋白质 酶,激素等大分 子的分子量测定. 子的分子量测定 上行法、下行法、 上行法、下行法、 环形法 糖类/氨基酸 多肽 糖类 氨基酸/多肽 氨基酸 多肽/ 有机酸/色素 色素/核苷 有机酸 色素 核苷 酸类/维生素 维生素/抗生 酸类 维生素 抗生 素/无机离子等 无机离子等
洗脱/ 洗脱 平衡 方法 应用
金属离子/有机酸 金属离子 有机酸/ 有机酸 氨基酸
c 按分离机制分 按分离机制分： 分配色谱(partition chromatography)：固定相是固 分配色谱 定液，利用固定液对各组分分配系数的大小不同 而实现分离。 吸附色谱（adsorption chromatography）：利用吸 吸附色谱 附剂对各组分的吸附的大小不同而实现分离。 离子交换色谱(ion exchange chromatography, IEC) 离子交换色谱 ：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团） 对各种离子的亲和力不同而实现分离。 空间排阻色谱（steric exclusion chromatography; 空间排阻色谱 SEC）：以各种凝胶为固定相，利用流动相中所 含各物质的相对分子质量不同而实现物质分离。 亲和色谱：利用生物分子间所具有的专一而又可 亲和色谱 逆的亲和力而实现生物分子的分离纯化。
2 柱色谱 2.1 吸附柱色谱 特点：吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生， 特点：吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生， 装置简单，具较高分辨率，广泛应用. 装置简单，具较高分辨率，广泛应用 a 原理 吸附作用： 吸附作用：固体表面的分子与固体内部分子所 受的吸引力不相等. 受的吸引力不相等 吸附层析柱(过程 过程) 吸附层析柱 过程
吸附色谱 定义 利用吸附剂对 各组分的吸附 力不同而实现 分离 吸附作用,吸 吸附作用 吸 附/解吸 解吸
离子交换色谱 利用离子交换剂上 的可解离基团（活 的可解离基团（ 性基团） 性基团）对各种离 子的亲和力不同而 实现分离
空间排阻色谱 以各种凝胶为固定相 ，利用流动相中所含 各物质的相对分子质 量不同而实现物质分 离
吸附剂预处理(除去杂质 增加吸附力 吸附剂预处理 除去杂质,增加吸附力 提 除去杂质 增加吸附力,提 高层析分离效果):氧化铝 活性炭,白土 氧化铝,活性炭 高层析分离效果 氧化铝 活性炭 白土 洗脱剂选择: 洗脱剂选择 考虑样品在溶剂中的溶解度; 考虑样品在溶剂中的溶解度 不与吸附剂起化学反应,不会使吸附剂溶解 不与吸附剂起化学反应 不会使吸附剂溶解 ; 洗脱剂的纯度要高,免受杂质影响 免受杂质影响. 洗脱剂的纯度要高 免受杂质影响
K= 组 在 定 中 浓 分 固 相 的 度 组 在 动 中 浓 分 流 相 的 度
固定相：多孔性固体支持物（如滤纸、硅胶、 固定相：多孔性固体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素 淀粉、硅藻土等）吸着一种溶剂（ 粉、淀粉、硅藻土等）吸着一种溶剂（此溶剂在层析 过程中始终固定在多孔支持物上）。 过程中始终固定在多孔支持物上）。 流动相：与固定相溶剂互不相溶的溶剂， 流动相：与固定相溶剂互不相溶的溶剂，可沿固定相 流动。 流动。
1.3 色谱法分类 a 按两相分子的聚集状态分 流动相 固定相 类型 液体 固体 液-固色谱 固色谱 液体 液体 液-液色谱 液色谱 -固色谱 气体 固体 气-固色谱 气体 液体 气-液色谱 液色谱 b 按固定相的固定方式分 柱色谱： 柱色谱： 填充柱色谱 毛细管柱色谱 平面色谱： 平面色谱： 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱
选择吸附剂时，注意 选择吸附剂时，注意: 吸附剂应有适当的吸附力,表面积大 表面积大; 吸附剂应有适当的吸附力 表面积大 颗粒均匀,在操作时稳定 不会破裂; 在操作时稳定,不会破裂 颗粒均匀 在操作时稳定 不会破裂 对被吸附物的吸附应是可逆的,即在一定 对被吸附物的吸附应是可逆的 即在一定 条件下可以解吸,以便洗脱 条件下可以解吸 以便洗脱; 以便洗脱 不会溶解在所采用的溶剂中,也不会引起 不会溶解在所采用的溶剂中 也不会引起 被吸附物的化学变化; 被吸附物的化学变化 对被分离物有足够的分辨力,即对不同物 对被分离物有足够的分辨力 即对不同物 质的吸附力有所不同. 质的吸附力有所不同
1.2 色谱法基本原理 色谱分析的目的： 色谱分析的目的：将样品中各组分彼此分离 。 两峰间的距离必须足够远， 两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是 由组分在两相中的分配系数决定的， 由组分在两相中的分配系数决定的，与色谱过程 的热力学性质有关。 的热力学性质有关。 两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽， 两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽， 以致彼此重叠，仍然不能分离。 以致彼此重叠，仍然不能分离。峰的宽窄是由组 分在色谱柱中传质和扩散行为决定的， 分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱 过程的动力学性质有关。 过程的动力学性质有关。