生物制药思考题

生物制药复习思考题：
一．核心复习题
1.药物研究与开发的基本过程？
确定疾病→分离出引起疾病的蛋白（2—5年）→找到针对疾病蛋白的有效药物（2—5年）→临床前实验（1—3年）→扩大生产→提法→人体临床试验（2—10年）→FDA批准（2—3年）
2.生物技术制药的定义、分类？
定义：采用现代生物技术、借助某些微生物、植物、动物生产医药品。

分类方法有三种：
按药物的化学本质和特性分类：（1）氨基酸及其衍生生类药物（2）多肽及蛋白质类药物（3）酶与辅酶类药物（4）核酸及其降解物和衍生物类药物（5）糖类药物（6）脂类药物（7）细胞生长因子类（8）生物制品类
按原料来源分类：（1）人类组织来源的生物药物（2）动物组织来源的生物药物（3）植物组织来源的生物药物（4）微生物来源的生物药物（5）海洋生物来源的生物药物
按生理功能和临床用途分类：（1）治疗药物：肿瘤、爱滋病、心脑血管疾病等（2）预防药物：传染性强的疾病，菌苗、疫苗、类毒素等（3）诊断药物：免疫诊断、酶诊断、放射性诊断、基因诊断试剂（4）其它生物医药用品
3.简述生物药物的定义、来源及特性？
定义：运用生物学、医学、生物化学等研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术、药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。

来源：（1）天然生物材料：人体、动物、植物、微生物和各种海洋生物等。

（2）人工生物材料
特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强、药理活性高、毒副作用小，营养价值高，生理副作用常用有发生；（2）在生产、制备中特殊性；（3）检验上的特殊性。

4.基因工程技术生产药物的优点及生产的基本过程？
优点：（1）大量生产难以获得的生理活性蛋白质和多肽；（2）提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；（3）发现，挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）改造和去除内源生理活性物质在作为药物使用存在的不足之处；（5）获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

生产的基本过程：
基本方法：将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶
细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，
最后将表达的目的蛋白提纯及做成制剂，
从而成为蛋白类药物或疫苗。

①获得目的基因
②组建重组质粒
③构建基因工程菌(细胞)
④培养工程菌
⑤产物分离纯化
⑥除菌过滤
⑦半成品检定
⑧成品检定
⑨包装
5.获得药用目的基因的方法？
（1）逆转录法：先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 的克隆表达。

mRNA的纯化→cDNA第一链的合成→cDNA第二链的合成→cDNA克隆 →将重组体导入宿主细胞→cDNA文库的鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴定
（2）逆转录——聚合酶链式反应法：mRNA经逆转录合成cDNA第一链→在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链
（3）化学合成法
前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因
先决条件：目的基因的核苷酸排列顺序/蛋白质的氨基酸顺序已知
限制：1.不能合成太长的基因（60-80bp）
2.遗传密码的简并性
3.费用高
用途：PCR引物、测序引物、定点突变、核酸杂交探针
6.真核基因在大肠杆菌中的表达方式？
（1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。

优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原，一般不做人体注射用药。

（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。

（3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。

7.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？
（1）外源基因的拷贝数：高拷贝数的表达质粒；
（2）外源基因的表达效率
①启动子的强弱：转录水平的高低
常用强启动子：lac、trp、λPL、tac、bla等
②核糖体结合位点的有效性
③SD序列和起始密码子ATG的间距：翻译效率
④密码子组成：“偏爱”大肠杆菌
（3）表达产物的稳定性：组建融合蛋白；利用信号肽；特异性突变；位点特异突变，改变二硫键位置；宿主蛋白酶缺陷
（4）细胞的代谢负荷：宿主细胞的生长与外源基因的表达
（5）工程菌的培养条件：host---Vector ---cloning gene
8.基因工程药物的表达体系有那些，它们有什么优缺点？
（1）原核表达体系：如大肠杆菌
优点：强启动子；翻译调控序列；多接头克隆位点。

缺点：缺乏转录加工机制；缺乏翻译后加工机制；表达产物形成不溶性包涵体；很难表达大量可溶性蛋白；表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。

（2）真核表达体系：如酵母、昆虫及哺乳动物细胞和植物细胞
优点：可适当修饰表达的蛋白质；一般具有天然活性；表达产物分区积累。

缺点：操作技术难、费时、不经济。

9.基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺有什么异同？
10.基因工程药物建立分离纯化工艺的依据及分离纯化的基本过程？
依据：（1）含目的产物的起始物料的特点：
①菌种类型及其代谢特性
②原材料和培养基的来源及其质量
③生产工艺和条件
④初始物料的物理、化学和生物学特性
（2）物料中杂质的种类和性质
（3）目的产物特性
（4）产品质量的要求
基本过程：
一般不应超过4—5个步骤
细胞破碎
固液分离
浓缩与初步纯化
高度纯化直至得到纯品以及成品加工
11.根据药物的不同特性，分离纯化蛋白质类药物的常用方法有那些，简述其原理？
12.重组蛋白质药物目标产品的质量控制项目？
（1）重组蛋白的鉴别（序列）（2）重组蛋白的纯度（杂质的类型）（3）重组蛋白的活性（检测方法）（4）重组蛋白的安全性（5）重组蛋白的稳定性（6）重组蛋白的一致性（构象与构型）
13.基因治疗的基本程序、临床应用及展望？
基本程序：（1）治疗性基因的选择（2）基因载体的选择（病毒载体、非病毒载体）（3）靶细胞的选择（体细胞、生殖细胞）（4）基因转移（间接体内疗法、直接体内疗法）（5）外源基因表达的筛选（利用在体中的标记基因）（6）回输体内
临床应用：（1）ADA（腺苷酸脱氨酶）缺乏症，T细胞受损，联合免疫缺陷（2）乙型血友病，逆转录病毒转移IX因子
（3）肿瘤的基因治疗，细胞因子，自然基因
展望：（1）进一步寻找切实有效的基因（2）精密调控外源基因在人体内的表达（3）体细胞移植和重建的生物学研究（4）减少外源基因对机体的不利影响
14.动物细胞的培养条件及其大规模培养的方法？
培养条件：（1）所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染（2）必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害离子（3）保证有适量的氧气供应（4）需随时清除细胞代谢中的有害产物（5）有良好的适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度（6）及时分种，保持合适的细胞密度
温度、PH、气体、渗透压、营养要求
培养方法：
根据培养细胞可分为原代培养和传代培养；
根据培养容器和方式可分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床和流化床培养；
实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。

微载体培养技术、中空纤维培养技术、微囊化技术
15.转基因动物的技术路线及其在医药行业中的应用？
技术路线：（1）通过手术从已交配的供体羊的输卵管中采集受精卵（2）用显微注射法向受精卵细胞核捣入人工构建的药物蛋白基因（3）经外科手术将受精卵移入同步发情的受体母羊的输卵管内（4）让受精卵在母羊体内发育至分娩出生。

在医药行业的应用：（1）人类疾病造模（2）药物产品的生产（3）异种移植
16.影响植物次级代谢产物产生和累积的因素有哪些？
（1）生物条件：外植体、季节、休眠、分化等
（2）物理条件：温度、光（光照时间、强度、光质）、通气（氧气）、酸度和渗透压
（3）化学条件：无机盐（N、P、K等）、碳源、物质生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质和前体等
（4）工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方式
17.转基因植物在制药工业上的应用？
（1）生产天然药物：人参细胞培养、红豆杉细胞培养、丹参发根生物反应器大规模培养技术、紫草细胞培养（2）生产抗体、重组疫苗、多肽类药物
18.免疫球蛋白的结构及功能分区？
结构：
抗体分子由一对轻、重链组成
轻链：一个V区、一个C区
重链：一个V区、3个C区
同一类型抗体的C区序列保守
V区序列则随抗原识别特异性不同而不同
互补决定区(CDR)
骨架区(FR)
基本结构（四肽链结构）
两条相同的重链(heavy chain,H链)
两条相同的轻链(light chain,L链)
功能分区：
VH · VL —结合抗原的部位
CH1 · CL—遗传标记所在
CH2 —具有补体结合部位
CH3 —与细胞表面Fc受体结合
铰链区—在CH1和CH2之间，富含脯氨酸，
易伸展弯曲，易被蛋白酶水解
超变区(hypervariable region, HVR)
可变区中一些特定位置的氨基酸显示更大的变
异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键
部位，故称超变区，又称互补决定区（complementarity-determining region，CDR）骨架区：可变区中变化较小的部分
抗原结合部位（antigen binding site）：轻链和重链的可变部分的20－30个氨基酸组成的囊装或裂隙状分子构象
*抗体的特异性决定于结合部位的构象
*两臂为抗原结合片断，Y的柄部为结晶片断
19.杂交瘤技术的原理及制备单克隆抗体的技术路线？
杂交瘤技术原理：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。

这两种细胞分别是经扩原免疫的小鼠和小鼠骨髓瘤细胞。

被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能。

但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。

在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持永生性的两种特征的细胞的克隆。

选择培养（HAT培养基）原理：选择性培养基常用HAT培养基(次黄嘌呤H、氨基蝶呤A及胸腺嘧啶T配成)----氨基蝶呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡;脾-脾融合细胞在培养几天后也会死亡，而杂交瘤细胞则可以存活。

20.噬菌体展示技术的原理和技术流程？
原理：将抗体通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体的表面，进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体，是噬菌体抗体库技术的核心
⏹噬菌体抗体在膜表面表达, 是通过Fab段或SCFV与单链噬菌体外壳蛋白
形成融合蛋白而完成
⏹既可识别相应的抗原并与其结合, 又能够感染宿主菌进行再扩增
⏹利用其可再扩增的特性，以靶抗原通过亲和吸附＋洗脱＋扩增，可筛选
到靶分子的配体肽链，再经突变和链置换方法改进抗体亲和力, 最终便获得高亲和力的特异性抗体
技术流程：
（1）获取目的基因：提取mRNA经反转录PCR获取抗体某一特定基因区段，抗体基因的组合形式多为单链抗体
（2）抗体库技术的载体：噬菌体载体具有噬菌体和质粒的共同特点
（3）淘筛：抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，反复使目的克隆大量扩增
（4）表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌，进行可溶性表达
21.抗体诊断试剂和抗体治疗药物有哪几类？
抗体诊断试剂：（1）荧光抗体诊断试剂，直接法、间接法
（2）免疫酶抗体诊断技术（3）放射免疫用抗体诊断试剂
抗体治疗药物：（1）放射性核标记的抗体治疗药物（2）抗癌药物偶联的抗体药物（3）毒素偶联的抗体药物
22.疫苗的基本成分，常规疫苗及新型疫苗有哪些类型？
基本成分：（1）抗原：灭活的细菌或病毒，通过多次传代得到的减毒细菌或病毒，病毒或细菌的提纯物，有效的蛋白成分，类病毒，细菌多糖，合成多肽，以及近年来发展的DNA 疫苗等（2）佐剂：能够增强抗原的特异性免疫应答的物质（3）防腐剂:保证疫苗在储存期不会被微生物污染(化学防腐剂)（4）稳定剂:保证抗原能够存活和维持
其免疫活性稳定的物质，(糖类，如乳糖、山梨醇等)（5）适当的缓冲剂、盐类等无活性的成分
23.酶在医药领域的四个方面的应用？
（1）疾病诊断方面：葡萄糖氧化酶；测定血糖含量；诊断糖尿病
（2）疾病治疗方面：透明质酸；治疗肝炎；肝硬化
（3）药物生产方面：青霉素酰化酶，作用于耐药性菌株，生产广谱青霉素（4）酶与生物医学工程：人工肾脏；尿激酶微囊；装置可降低血液中尿素达80％
二.名词解释
生物技术制药真核表达载体质粒的结构不稳定
连续培养种子批系统高密度发酵
肽图分析基因补偿性治疗“自杀基因”的基因治疗抗原决定簇/表位互补决定区/超变区单链抗体
抗体融合蛋白细胞内抗体竞争法ELISA
亚单位疫苗DNA疫苗肽疫苗
接触抑制中空纤维式生物反应器冠瘿组织培养
生物技术制药：采用现代生物技术、借助某些微生物、植物、动物生产医药品。

真核表达载体：用真核细胞作载体表达，如酵母、昆虫及哺乳动物细胞和植物细胞
质粒的结构不稳定：外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

连续培养：连续培养又叫开放培养，是相对分批培养或密闭培养而言的。

连续培养是采用有效的措施让微生物在某特定的环境中保持旺盛生长状态的培养方法。

种子批系统：不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，由原始种子批建立生产用工作细胞库，原始种子批须确定克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存以预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统。

高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。

肽图分析：用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。

基因补偿性治疗：指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得以加强。

目前基因治疗多采用此种策略。

“自杀基因”的基因治疗：某些病毒或细菌产生的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体，在人体细胞内一系列酶的催化下转变为细胞毒性物质，从而导致细胞死亡。

抗原决定簇/表位：抗原分子中能与抗体或淋巴细胞表面受体结合的特定部分，即在分子构象上与抗体互补的部分，或者说是能与抗体分子嵌合的化学基团。

一般由5—8个氨基酸残基、短寡糖残基或核苷酸残基组成。

互补决定区/超变区：可变区中一些特定位置的氨基酸显示更大的变异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，故称为超变区，又称互补决定区。

单链抗体：采用共价结合的方式将VH和VL连接而成的可增加FV片段的稳定性的一种小分子抗体。

抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。

细胞内抗体：主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体(intrabody)，其中抗gp120 的Fab 段和抗Tat ScFv 已进入临床试用。

竞争法ELISA：ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体─聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

亚单位疫苗：提取或合成细菌或病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定簇制成的疫苗。

如流脑、流感疫苗、肺炎疫苗等。

DNA疫苗：这种核酸分子是一种细菌的质粒，在克隆了特异性的基因以后，能在真核细胞中表达蛋白质抗原，刺激机体产生特异性体液和细胞免疫。

肽疫苗：将构成病毒衣壳的蛋白连接到载体蛋白上，以提高小肽的稳定性。

接触抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即细胞与周围细胞接触时，细胞就停止增殖。

中空纤维式生物反应器：细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维中外表面。

冠瘿组织培养：有些药用植物的活性成分仅在叶片和茎轴中合成，利用冠瘿组织培养易于得到这些物质，冠瘿组织的获得，是有根瘤农杆菌感染植物组织，
Ti质料转化后获得冠瘿瘤，经过除菌后，从冠瘿瘤培养获得的；具有激素自养、增殖速度快等特点，也可以进行液体培养。

三. 题型
选择题 15%
填空题 15％
名词解释 25％
简答题 30％
综合题（应用型论述题） 15％。