实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物

实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定
一实验目的
1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。

2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。

3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。

二实验原理
质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。

细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。

质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。

SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。

所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。

释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。

然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。

离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。

通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。

（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。

一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。

（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧
光，且荧光的强度与DNA含量成正比。

三药品器材
一器材
1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）
2.台式离心机与高压灭菌锅
3.超净工作台、摇床和各式加样枪
二试剂
1.溶液Ⅰ
50mmol/L葡萄糖
10mmol/L EDTA，20mmol/L
20mMTris-HCl pH8.0
100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）
溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。

2.溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH贮存液现用现稀解）
1%SDS（临用前用10mol/L SDS贮存液现用现稀解）
3.溶液Ⅲ
60mL 5mol/L 醋酸钾，5ml 冰醋酸，28.5mL H2O
4.TE缓冲液
10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA（pH8.0）
5.100%乙醇，70％乙醇
6.上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V)蔗糖水溶液或30％的甘油
7.5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液
445 mmol/L Tris碱， 445 mmol/L 硼酸盐， 10 mmol/L EDTA 称取54g Tris碱、27.5g 硼酸溶于500ml蒸馏水中，加入20 ml 的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）混匀，补加蒸馏水至1000ml，40C冰箱贮存。

8.5×Tris-乙酸（TAE）缓冲液
2mol/L Tris碱，1mol/L 乙酸，100 mmol/L EDTA
称取242g Tris碱溶于500ml蒸馏水中，加入57.1 ml冰乙酸（17.4 mol/L）及200ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）混匀，补加蒸馏水至1000ml，40C冰箱贮存。

三材料
1.含有质粒大肠杆菌
2.琼脂糖
四实验方法
一、质粒DNA的提取
1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃振荡培养12～16小时，到细菌对数生长期即可收获;
2.取3ml细菌培养液（分2次，每次1.5ml）于Eppendorf
管中，10，000 × g离心1分钟，弃上清液（尽可能完全）；
3.加入100ul冰预冷的溶液Ⅰ，剧烈振荡使细胞完全重悬；
4.加入200ul新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒4次，轻轻混合，将离心管放置于冰上；
5.加入150ul冰预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10秒钟使溶液Ⅲ均匀地分散在细菌裂解物中，置冰浴放置3～5分钟；
6.12，000 × g 离心5分钟，将上清液移入另一离心管中；
7.加等量酚：氯仿，振荡混匀，用台式高速离心机，10000r/min 离心7min，上清移入另一干净离心管；
8.加2倍体积的100％乙醇混匀，于室温净置5分钟沉淀双链DNA；
9.用台式高速离心机
于40C、12000r/min离心5min；
10.小心倒弃上清，将离心管倒置于滤纸上将剩余液体滴尽；
11.用1ml70％乙醇于40C洗涤双链DNA沉淀，按步骤11去上清，在空气中使沉淀干燥10分钟；
12.取50ul含胰Rnase A（20ug/ml）无Dnase的TE重新溶解
质粒DNA，于-200C冰箱贮存备用。

二、质粒DNA含量测定
1.取2ul提取的质粒DNA，加入98ul蒸馏水对待测DNA样品进行1:50倍(或更高倍数的稀释);
2.蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。

3.加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。

260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50mg /ml 双链DNA，33mg /ml单链。

可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。

一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染
4.记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:
dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数（注：浓度单位为mg /ml）
三、质粒DNA的琼脂糖电泳
1.琼脂糖凝胶的制备:称取05g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。

2.胶板的制备:取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。

将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒入有机玻璃内槽，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。

室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。

制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE （Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。

3.加样:用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。

每加完一个样品，换一个加样头。

加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20 ul。

在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6ul 的 1 kb DNA ladder （50ng/ul ）。

4.电泳（带上手套操作）:加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在80～100V的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约
1cm处停止电泳；将凝胶放入溴化乙啶（EB）工作液（0.5ug/ml左右）中染色约20min。

为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）。

电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。

在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。

5.观察与拍照:在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。

DNA 存在处显示出红色的荧光条带。

紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。

在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。

拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。

五注意事项:
1.收获细菌应在其对数生长期，此时细菌生长活跃，死菌较少，质粒产量高。

2.质粒提取过程中，溶液Ⅱ应现用现配，不亦贮存。

3.在质粒提取的整个过程中都应特别注意DNase污染，防止质粒DNA被DNase水解。

4.质粒提取过程复杂，在抽质粒前一定要充分作好准备，将器具、离心管、枪头等消毒。

5.质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳时，要特别注意EB的使用，因为EB是一种诱变剂，有致癌作用，操作时戴塑料或乳胶手套。

六思考题:
1.质粒抽提用具、试剂为何要高压灭菌？
2.溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用是什么？
3.质粒抽提取过程为何要防止DNA酶污染？
4.细菌收获的最佳时期是什么时期？
5.质粒DNA电泳时为何要加EB？为何又要特别小心？
6.质粒DNA的电泳图谱为何有时只有1条带谱，有时又有2～3条带谱？为什么？。