总RNA提取,cDNA第一条链合成,cDNA纯化,3‘端加尾实验,荧光定量PCRprotocol

RNA Extraction Protocol
1.实验原理
异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！
✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放
✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离细胞或组织
1. 样品裂解
2. 分离总RNA
2.实验试剂与器材
2.1实验试剂
RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC 水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT （Thermo）。

2.2实验器材
微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，枪头。

3.实验前准备工作
实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、枪头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。

提前20min打开低温离心机预冷。

准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。

4.实验步骤
4.1取样
（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。

TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

（3）细胞悬液：300~500g离心10min收集细胞，每5～10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

4.2 RNA提取
（1）匀浆：取50~100mg保存在-80°C或保存在RNA保护液（RNAfixer，百泰克生物公司）中的组织加入800μl Trizol充分匀浆（匀浆机调到4或者5档，一次5s，一共2~3次。

匀浆的时候不要贴着管壁，尽量减少泡沫的产生），每次匀浆完一个样品要用沾有75%酒精的纸擦拭匀浆机的钻头。

（2）裂解：加入200μl Trizol，充分剧烈震荡15s，在冰上静置5min；4℃，12000g，离心10min。

（3）分离：将离心后的上清液转移到另一离心管，加入250μl氯仿（动作要快，氯仿见光分解），剧烈震荡30s，室温放置3min；4℃，12000g，离心15min。

（4）沉淀：将离心后的上清液转移到另一离心管（注：切记不要吸到中下层溶液，宁可少吸一些上清），加入500μl预冷的异丙醇（提前在冰上放置），上下颠倒混匀，于-20℃放置15min；4℃，12000g，离心10min，弃异丙醇上清，收集沉淀。

（5）洗盐：在收集的沉淀中加入1ml的75%乙醇（预冷，无RNase，优级纯，RNA 提取专用），上下颠倒混匀（4~5次）；4℃，12000g，离心5min，吸出75%乙醇弃去，留下沉淀。

（6）保存：在沉淀中加入1ml无水乙醇，保存于-80℃（一般最多可以保存1个月）。

（7）取出3~5μg（芝麻粒大小）保存于无水乙醇中的RNA，加入30μl DEPC水中，取2μlRNA 用于琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

（8）取2μlRNA用紫外分光光度计检测其A260值、A260/A280值。

纯净的RNA的A260/A280应在1.8~2.2之间。

（9）提完RNA后用酒精清洗匀浆机的钻头，擦干低温离心机内壁上的水，关闭电源。

4.3 cDNA第一条链的合成
使用Permentas的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（＃K1622）试剂盒，按照使用说明书方法进行，具体如下：
（1）在0.2ml的PCR管中加入以下反应体系：经检测合格的0.1ng-5μgRNA
（RNA含量较低可以多管合在一起），1μl Oligo(dT)18 Primer(0.5μg/μl)，无RNase 的水至12μl，轻微均匀，简单离心，65℃孵育5min。

（2）反应结束后至于冰上冷却2min；然后按顺序加入5×Reaction Buffer 4μl，RNA
酶抑制剂（20U/μl）1μl , 10mM dNTP Mix 2μl，M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μl) 1μl，使总体积达到20μl，轻轻混匀，然后离心（掌上离心机离心8s，将PCR管壁沾染的液体甩净），42℃反应60min，70℃温育5min以灭活M-MuLV反转录酶。

（3）对于随机引物扩增的cDNA加入上述体系后，先25℃，5min.然后42℃，60min；70℃，5min灭活M-MuLV反转录酶。

（4）扩增基因的3’端可以用Oligo(dT)进行逆转录，扩增基因的5’端可以用随机引物或者5’RACE特异性引物进行逆转录。

注：对于GC含量较高的模板，反应温度可以升高到45℃。

4.4 cDNA第一条链的纯化
使用Promega的Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Systerm （USA，Lot295687）试剂盒，按照使用方法进行，具体如下：
（1）向PCR扩增产物中加入20μl（等体积）的Membrane Binding Solution
（2）将收集柱插入收集管中，将上述PCR产物转移到收集柱中，室温下孵育1min,16000g离心1min，弃收集管中的废液，将收集柱重新插入收集管中。

（3）在收集柱中加入700μl的Membrane Wash Solution ，16,000g离心1min，弃收集管中的废液，将收集柱重新插入收集管中。

（4）在收集柱中加入500μl的Membrane Wash Solution ，16,000g，离心5min。

（5）将收集管中的废液弃去，将收集柱重新插入收集柱中再次离心1min，打开收集柱的盖子，使Membrane Wash Solution 挥发掉。

（6）轻轻将收集柱转移到一个灭菌的1.5ml离心管中，在收集柱中加入50μl无核酸酶的蒸馏水中，室温孵育1min，16,000g离心1min，弃收集管，将收集液保存在-20℃，留待cDNA 3’末端添加PolyC。

4.5 纯化的cDNA 3'末端添加PolyC
（1）0.2ml PCR管中加入如下反应体系：2μl灭菌双蒸水，4μl 5×TdT Buffer，2.5μl dCTP(2mM)，10μl纯化的反转录合成的cDNA 第一条链，1.5μl末端转移酶（Thermo，USA），终体积20μl。

（2）混合均匀，简单离心后，37℃反应15min，最后70℃，10min使末端转移酶失活。

产物可以用来后续基因的5’RACE扩增。

ABI 7300/7500 system荧光定量PCR操作流程1.实验原理
所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图（如下图）。

一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。

在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT 值。

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。

每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被
称为CT 值（threshold value ）。

CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct 值。

因此，只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。

前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光，变性时，DNA双链分开，无荧光
相对定量分析用来测定一个样本中目的基因与内参基因（持家基因，比如β-actin，18S rRNA）的相对变化变化，因为它们的表达水平趋于相对稳定。

结果用RQ值来表示。

7300/7500 PCR仪系统软件只使用比较法( ∆∆CT) 来计算核酸序列的相对定量结果。

即RQ值= 2^-△△Ct，其中△△Ct=[(待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因
平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值)]
2.操作之前的准备：
1：提RNA，逆转录，用普通PCR检测引物，PCR反应的体系和条件除了引物加0.5 ul，其它的与基因克隆的一样。

2：内参基因的选择：多数物种一般以Beta actin 和18 S RNA基因为内参。

可参照前人的序列（文献中有报道的）。

其中贻贝18S RNA的序列是参考Cubero and colleagues (2012) 的序列。

3：加样可总结为三个词：快，准，轻柔，无污染。

操作时带手套，在96孔板中操作。

加好样定量膜要压实，且不能用手直接碰，避免影响后续荧光的吸收。

3.软件操作
先做扩增曲线，等反应结束后再做熔解曲线（7500system 要分开做，7300system 可以将熔解曲线添加到扩增曲线后面一起做）。

2.1扩增曲线的操作
选择File （文件）> New （新建）。

从Assay （实验）下拉列表中，选择
Relative Quantification (ddCt) Plate（相对定量(ddCt) 反应板），然后单击Next > （下一步> ）。

将所要检测的基因名添加到反应板文件中，然后单击Next > （下一步> ）。

（如果没有所要的基因名字，可以选择New detector新建一个基因名）
然后为每个反应孔指定基因和任务，把内参基因的特征改为ENDO（作为校正）然后单击Finish （完成）。

在Well Inspector （反应孔设定）窗口（依次选择View（视图）> Well Inspector（反
应孔设定））中，输入样本名（如果较多，也可以先不设置，等实验结束后在再自己的电脑上进行设置）
选择Instrument （仪器）选项卡。

默认情况下，显示两步法反转录- 聚合酶链
反应(RT-PCR) 方法中PCR 步骤的标准PCR 条件。

也可以根据自己的基因引物的最适条件相应的做出更改调整。

设置程序：95℃10min；95℃15s,60℃20s,68℃35s,40个循环（参照天根试剂盒的说明），选择20ul体系进行扩增，选择step 3 进行Data collection。

7300与7500的区别
选择File （文件）> Save As（另存为），输入相对定量反应板文件的文件
名，然后单击Save（保存）。

将反应板装入仪器中。

单击Start（开始）。

2.2. 熔解曲线的操作
扩增曲线结束后继续做熔解曲线分析，打开7500 system，新建new, 选择Discusion,。

选择要做定量的基因，对96孔板中每个样进行基因的选定，不需要对每个样进行命名，所有的和扩增曲线的对应即可。

然后在Instrument选择20ul体系进行扩增保存文件。

Start，大概需要运行37分钟。

2.3结果分析
选择File （文件）> New （新建）。

从Assay （实验）下拉列表中，选择
Relative Quantification (ddCt) Study（相对定量(ddCt) 研究），然后单击Next > （下一步> ）。

单击Add （添加），将反应板添加到研究中，然后单击Open（在一个RQ研究中，可添加最多10 个相对定量反应板。

）。

单击Finish （完成）。

使用Auto Ct （自动Ct）选项设置反应参数（）并分析数据。

如果知道所作实验的最佳基线和阈值设置，可选择Manual Ct （手动Ct）和Manual Baseline （手动基
线）选项。

单击或选择Analysis （分析）> Analyze（执行分析）以再次分析数据。

在RQ Results （相对定量结果）窗口中单击一个选项卡，以查看分析结果。

如果需要，保存此相对定量研究(RQ Study) 文件。

LightCycler480荧光定量PCR仪操作规程1.基本操作
1.1．样本处理，在PCR实验室的样本处理区进行，可使用各种符合各实验目的要求的方法进行提取核酸的处理。

实验员必须戴上一次性PE手套、口罩和帽子，穿上该处理区的白大褂。

1.2．将提取的核酸溶液通过传物通道转移至PCR实验室的试剂配制区，进行试剂盒的配液和加样操作。

在操作过程中，切忌戴乳胶手套接触光学透性封板膜。

1.3．试剂加完样，封膜完毕后，在板式离心机中1500×g（3000rpm）离心两分钟，以排除气泡。

1.4．打开总电源，打开LightCycler480仪器后方的电源开关，然后打开连接LightCycler480荧光定量PCR仪的电脑，并打开LightCycler480 Software软件，此时仪器会在与电脑软件接通后进行自检，仪器正面右边两盏桔黄色的灯会闪烁。

自检完毕后，左边的灯会变绿，右边的灯仍为桔黄色。

这时按一下灯右边带双箭头的开关，仪器的载板器会自动伸出，将准备好的反应板放入载板器中（反应板的切角方向应与载板器的切角方向相应才能将反应板正确放入，切勿用裸手接触反应板的光学透性封板膜）。

再按一下带双箭头的开关，仪器的载板器会自动缩入仪器内，此时仪器能自动检测到反应板，原来呈桔黄色的灯会变绿，LightCycler480 Software中Start Run按钮也同时变为激活状态。

1.5．设定完实验程序并编辑完样本后，点击软件中Start Run按钮，运行实验。

1.6．软件界面上出现Run Complete….标识时，说明实验运行完毕，按一下仪器上带双箭头的按钮，使载板器伸出，取下反应板，再按一下带双箭头的按钮，使载板器缩回，关闭LightCycler480仪器后方的电源开关，在电脑上分析实验数据。

1.7．分析完实验数据后保存结果，打印报告，并关闭电脑，关闭总电源。

实验员在离开PCR扩增区时带走用完的反应板。

2.仪器维护
LightCycler 480是一台免维护的仪器。

做任何维护工作前，须确认主机电源已被关闭。

预防性维护：
1．检查LightCycler 480主机两侧与背后空间，确保无任何阻碍空气流通的物品，包
括书本、纸张或其他任何物品；
2．若主机表面和桌面有灰尘，用不起毛的软布蘸少量清水擦拭干净。

清洁性维护：
若有需要，可用性质温和的商品化清洁剂或70％的乙醇溶液对LightCycler 480主机表面、热循环96孔模块和热盖进行清洁。

清洁96孔热循环模块：
1. 用移液器移取125μl 70％乙醇溶液或异丙醇至所有孔内；
2. 15分钟后，使用移液器对孔内溶液进行多次吹洗；
3. 移除孔内的液体，并使96孔模块孔内自然风干；注意操作时不要让清洗液腐蚀热循环模块的涂层。

3.软件操作
3.1启动软件
1.开启计算机，并以正确的使用者名称与密码登入Windows。

2.开启LightCycler 480 软件，并输入正确的使用者与密码。

User name: admin
Password: LightCycler480
3.2软件设定-- 开启新实验
•设定新实验
1.软件开启后，会进入主画面。

点选“New Experiment”。

2.出现实验设定窗口。

任何时候需要回主画面的话，点选画面右边的
按钮。

•设定实验
❖若要套用设定好的实验步骤(Template)，请跳至6.。

1.在实验设定画面上方，先选择适当的Detection Forma t。

选项包含:
另外可再点选“Customize” 勾选所需的滤片组合。

2.输入反应体积: 96 well plate 范围为10-100 ul，而384 well plate 范
围为5-20 ul。

3.设定实验步骤(Program)
•设定program，包含有Pre-incubation, Amplification (PCR), Melting curve (optional) 与Cooling。

利用『+』与『－』增加
或删除步骤。

•设定循环数目(Cycle) 与分析模式。

通常Amplification (PCR) program设定成『Quantification』，而Melting Curve program 设
定成『Melting Curve』。

4.设定详细温度变化(依照不同实验方法与设计而有所不同)
•点选各个program 即可设定详细温度变化步骤，请根据产品说明书来设定，利用『+』与『－』增加或删除步骤。

需要设定的参数包含Target (℃) 目标温度，Acquisition Mode (荧光侦测模式)，Hold (hh:mm:ss) 停留时间。

Ramp Rate (℃/s) 为升降温速度，范围如下：
Ramp Rate (℃/s) Heating up Cooling down
96-well Block 1.0 – 4.4℃/s 1.0 – 2.2℃/s
384-well Block 1.0 – 4.8℃/s 1.0 – 2.5℃/s
❖若设定温度低于50℃，请把Ramp Rate调整成1.5℃/s (96 well) 或
2.0℃/s (384 well)。

5.将实验步骤储存成『Template』以便下次进行套用。

点选左下角
“Save As Template” 即可把此步骤储存起来。

6.若要进行套用时，请直接点选窗口左下角
“Apply Template” ，选择欲套用之实验步骤即
可。

7.设定完成后点选“Start Run” 开始进行实验。

8.跳出档案储存窗口，请输入欲储存之文件名称。

❖实验进行中会进入另一个Data窗口，窗口下方按键功能如下：
✓End Program : 结束此Program, 进入下一个Program。

✓+ 10 Cycles : 实时增加循环数目。

✓Abort Run: 马上结束此实验，请注意，若按此键，则此次实验的结果将不储存。

3.3样品编辑
•将样品分群
1.点选窗口左边的“Subset Editor”。

2.点选“New” 新增新的群组，并将其命名。

3.利用鼠标选取此群组之样品位置，点选窗口右下角“Apply” ，此时
被选取的样品位置会呈现实心的蓝色，如下图。

4.以此方式依序将所有样品群组编辑完毕。

❖样品必须分群才能够独立分析，但是样品是否分群并不影响样品的Cp 值。

•编辑样品名称
1.点选窗口左边的“Sample Editor”。

2.输入每个位置之样品名称(Name)与重复
(Repl. Of)。

3.若要更快速输入，可直接在左边的图上点选欲编辑之样品：
❖若A1, A2 与A3 为三重复，在A2 与A3 Repl. Of 字段上都填上A1 即为三重复。

❖在编辑过程中，可利用『Ctrl』+『C』复制文字，『Ctrl』+『V』贴上文字。

4.根据实验分析模式，编辑Abs Quant (绝对定量)，Rel Quant (相对定
量)，或Genotyping 分页，设定Sample Type。

绝对定量(Abs Quant)：
『Unknown』:未知浓度样品
『Standard』: 已知浓度标准品
相对定量(Rel Quant)：
『Target』: 目标基因
『Reference』: 参考基因
『Calibrator』: Control 样品
『Standard』: 已知浓度的样品
『Unknown』:未知浓度样品
5.若设定成『Standard』之样品请输入浓度。

6.若想要将此样品编辑储存成Template，可点选窗口左下角“Save As Template” 即可，下次实验时可点选“Apply Template” 进行套用。

3.4．结果分析
•点选左边的“Analysis”，选取分析模式，并选择所需分析之群组，如下图：
2.
1.
3.
分析模式说明
Abs Quant / 2nd Derivative Max 绝对定量(自动法)
Abs Quant / Fit Points 绝对定量(手动法)
Color Compensation 色差校正(多色实验校正用)
Gene Scanning 基因扫描(适用于High Resolution Melting Curve, HRM 分析)
Genotyping
基因分型(适用于HybProbe 之
基因分型实验)
Relative Quantification 相对定量
Tm Calling Tm 分析
•绝对定量(Absolute Quantification)
1.点选下方的“Calculate” 即可得到样品之Cp 与标准曲线。

各个样品之Cp 值与浓度
重复样品平均后之Cp值与浓度, 并自动计算标准差
2.数值之数据输出: 在数值分析表上按鼠标右键，点选“Export” 即可
输出成.txt 档案格式。

可直接以Microsoft Excel 软件开启。

3.图形输出: 在图形上按鼠标右键，点选“Export” 即可输出成各种图
形档案格式。

4.标准曲线储存: 点选窗口下方Std Curve之“Save as external”，输
入适合档名后即可储存在数据库中。

•相对定量(Relative Quantification)
1.在选择相对定量分析后，出现下面窗口：
❖Reference Sample Location: 若Reference (Housekeeping gene) 之样品在同一盘上请选择“In-Run”，否则请选择“External” 可输入另一次实验的数据一起分析。

❖建议将Auto Pair打勾让计算机自动将样品配对。

2.进入『Target』与『Reference』分页，右下角显示“Eff = 2” 表示
将目标基因与参考基因的PCR 效率以2.0 来计算。

3.若需要校正目标基因与参考基因之PCR 效率，则需要输入标准曲
线。

在『Target』与『Reference』分页之右下角，输入(import) 标准曲线。

❖Use in run：输入(import) 同一盘上之标准曲线。

❖Use external：输入(import)之前已储存于数据库中之标准曲线。

4.点选『Pairing』分页，检查计算机自动配对结果是否正确。

其中，
红色表示Unknown样品，绿色表示Calibrator 样品。

若欲外加配对，则可直接以鼠标点选样品后按“Add” 即可增加配对。

5.点选『Results』分页，点选“Calculate” 即可得到计算结果。

6.数值和图形输出与绝对定量相同。

(请参考绝对定量) •Tm 分析(Tm Calling)
1.进入Tm 分析窗口
2.确认波峰数目
3.选择检测模式
4.点选“Calculate＂即可得到每个样品之Tm 值。

3.5报告(Report)
1.将分析后结果储存后即可点选报告键。

数据储存报告
2.勾选想要呈现的报告内容。

3.点选“Generate” 即可产生报告。

4.点选“PDF” 即可将此报告储存成.pdf 档案格式。

3.6数据转移至其它计算机(数据输出与输入)
•数据输出
1.点选(navigator)
2.点选所要输出的实验档案，点选即可将档案输出
成.ixo 档案
3.将此ixo档案以光盘或随身碟存到另一计算机
•数据输入
1.分析计算机上开启LightCycler 480 软件，登入后点选
2.点选，选取所要输入的.ixo 档案并开启，即可开始
进行实验数据分析
3.点选将此实验档案储存至数据库中。