牦牛与其他家牛属动物SRY基因多态性及其父系进化关系分析

牦牛与其他家牛属动物SRY基因多态性及其父系进化关系分
析
蔡欣;赵芳芳;孙磊
【摘要】为分析牦牛与其他家牛属动物SRY基因多态性及其父系进化关系,从5个麦洼牦牛个体基因组DNA扩增克隆SRY基因,同时从GenBank检索家牛属物种及野牛的SRY基因序列,分析家牛属物种在SRY基因的多态性及其SRY蛋白中HMGbox区域基因序列的变异特征,并基于SRY基因序列构建家牛属物种间的父系系统进化树及其网络中介图,分析进化关系.家牛属物种编码SRY蛋白N、C两端氨基酸(HMG-box侧翼)基因序列的错义突变率(0.57)显著低于编码HMG-box区域基因序列的错义突变率(0.69),推测家牛属物种间在SRY基因进化过程中的正选择同时作用于编码HMG-box及其侧翼区的基因序列;相对水牛和牦牛,欧洲野牛与黄牛的亲缘关系更近,此结果从父系侧面支持现存的黄牛牛种由已经灭绝的野牛或原牛驯化而来的观点;牦牛可能有2个或多个父系祖先;非洲水牛和江河水牛与其他牛种之间在SRY基因存在较多变异导致明显的分歧进化,也支持可划分为沼泽型和江河型2个亚种的论断.所以,家牛属物种间在SRY基因具有特殊的变异特征,物种间的父系进化关系分析结果支持前人论断.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2014(041)005
【总页数】6页(P190-195)
【关键词】牦牛;家牛属动物;SRY基因;变异特征;父系进化关系
【作者】蔡欣;赵芳芳;孙磊
【作者单位】西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;西南科技大学
生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010
【正文语种】中文
【中图分类】Q23
黄牛（Bos taurus）、牦牛（Bos grunniens）和水牛（Bubalus bubalis）属于
哺乳纲（Mammalia）偶蹄目（Artiodactila）反刍亚目（Ruminantia）洞角科（Cavicornia）牛亚科（Bovidae）家牛属（Bos）。

大量研究以mt DNA变异为依据对以上家牛的母系起源分类及其相互关系进行了深入探讨，黄牛可划分为普通牛（Bos taurus）和瘤牛（Bos indicus）（Lei等，2006；Cai等，2007；Ca等，2010），且牦牛、斑腾牛（Bos banteng）和牛（Bos gaurus）与黄牛可能有过基因交流（蔡欣等，2007）。

牦牛有2个母系来源或有2个主要的驯化地点，与
普通牛也有部分基因交流（Lai等，2007；Qi等，2010）。

水牛可划分为沼泽型和江河型2个亚种，且有独立的母系起源（Kumar等，2007；Lei等，2007）。

但是，以上家牛属物种之间的父系进化关系目前尚未阐明。

SRY基因是哺乳动物
重要的性别决定基因，定位于Y染色体上靠近拟常染色质区的非重组区域，具有
较高的保守性，涵盖完整的进化信息，因此成为研究动物父系起源和系统分类的重要分子标记（Kikkawa等，2003；张亮等，2004；白文林等，2009）。

本研究
通过克隆麦洼牦牛SRY基因和GenBank检索的其他家牛属动物SRY基因序列，
分析黄牛、牦牛（Bos grunniens）、水牛（Bubalus bubalis）、斑腾牛（Bos javanicus）、大额牛（Bos frontalis）和欧洲野牛（Bison bonasus）在SRY基
因变异特征及相互间的父系进化关系。

1.1 样本来源从四川省红原县麦洼牦牛原种群场中随机抽出多头牦牛个体为研究
对象，并采取每个个体的静脉血、耳组织块或毛发样品，处理后低温送回实验室。

1.2 方法
1.2.1 牦牛基因组DNA的提取麦洼牦牛血液基因组DNA的提取按照酚-氯仿抽提法提取，确保高纯度、无蛋白和RNA污染，选择提取质量较好的5个牦牛个体DNA样品用作SRY基因扩增模板。

1.2.2 引物设计根据GenBank已发表牦牛SRY基因序列（登录号：DQ336531）（Nijman等，2008）设计引物扩增麦洼牦牛SRY基因序列，引物预扩增的目的
片段在该SRY基因序列603-1867 bp之间，包含5′-端序列和ORF序列，预计扩增片段大小为1265 bp。

引物序列为：SRY-P1：5′-TGGAGAAGCAGGGATAGT-3′；SRY-P1：5′-AAATTAAGTCGCAGGTGA-3′。

引物由北京梓熙生物技术公司
合成。

1.2.3 PCR扩增PCR反应总体系50μL：10× Buffer 5μL，Mg2+（25 mmol/L）3μL，d NTPs（10 mmol/L）4μL，模板DNA（20 ng/μL）2μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25μL，超纯灭菌水
33.75μL。

PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃延伸7 min，12℃终止反应。

1.2.4 克隆测序 5个牦牛个体SRY基因序列PCR产物与p MD19-T载体连接后转化JM109感受态菌株并鉴定阳性克隆，每个牦牛个体挑取阳性至少2个已鉴定阳性克隆扩大培养后进行正反向测序。

1.2.5 家牛属动物SRY基因变异特征和及其父系进化关系分析在GenBank检索黄牛、牦牛（Bos grunniens）、水牛（Bubalus bubalis）、斑腾牛（Bosjavanicus）、大额牛（Bos frontalis）和欧洲野牛（Bison bonasus）SRY 基因序列，通过应用Clustal W2软件进行多序列比对。

用Mega 5.2分析不同牛种SRY基因单倍型及其DNA序列和氨基酸序列变异位点，用UPGMA法构建不
同牛种的分子系统树。

通过NETWORK 4.6.1.1软件基于不同单倍型之间变异位点构建网络中介图。

2.1 麦洼牦牛SRY基因的克隆测序从5个麦洼牦牛个体血液样品提取的基因组DNA比较完整（图1A），以其为模板通过PCR扩增到SRY基因序列1265 bp （图1B），筛选阳性克隆后提取重组质粒进行PCR扩增鉴定（图1C），并对多
克隆测序序列进行分析，获得5个牦牛个体SRY基因序列，长度为1265 bp，包含了该基因ORF序列690 bp及其上游序列505 bp和下游序列70 bp。

2.2 家牛属动物SRY基因变异特征麦洼牦牛及其从GenBank获得的22条SRY
基因序列共有51个核苷酸替换突变位点，共定义出13个单倍型（表1），本研
究测序克隆的5个麦洼牦牛个体SRY基因序列分属于H1和H2单倍型。

以普通
牛SRY基因序列（GenBank登录号：DQ336526）为参考，不同单倍型之间变异位点及其类型见图2。

由图2可知，51个替换突变中有34个分布在SRY基因的ORF序列中，其余的突变位点分布在ORF上游序列中；SRY基因的ORF序列34个替换突变中有13个分布在编码HMG-box区域的序列中。

SRY基因51个替换突变中，29个为转换突变，22个为替换突变。

以普通牛SRY序列（登录号：DQ336526）为参考，通过变异分析发现13个单
倍型间氨基酸变异位点有21个（图3），因此可以推断，分布在SRY基因ORF
序列中的34个替换突变中有21个为错义突变，导致SRY蛋白中氨基酸序列改变，而其余13个为同义突变。

13个单倍型在SRY蛋白21个氨基酸变异位点中，有9个分布于SRY蛋白的HMG-box区域。

因此，分布于SRY蛋白N、C两端（HMG-box侧翼）的错义突变率12/21=0.57，显著低于SRY蛋白中HMG-
box区域的错义突变率9/ 13=0.69。

2.3 家牛属动物间父系进化关系分析基于SRY基因序列以山羊（EU581862）为
外群、欧洲野牛（Bison bonasus）为参考，构建的家牛属动物父系分子系统树见
图4。

由图4可知，相对水牛和牦牛，欧洲野牛（Bison bonasus）与黄牛的亲缘关系更近，且普通牛（Bos taurus）、瘤牛（Bos indicus）、斑腾牛（Bos javanicus）和大额牛（Bos frontalis）之间具有更近的亲缘关系。

牦牛可能分化为2个以上类群/品种，而江河水牛（Bubalus bubalis）和非洲水牛（Syncerus caf fer）明显分化为不同亚种。

从家牛属动物及其野牛SRY基因13个单倍型的网络中截图更简洁地显示各单倍型的变异与不同牛种的分类，结果见图5。

由图5可知，非洲水牛（Syncerus caffer）（H9）和江河水牛（Bubalus bubalis）（H10）与其他牛种之间在SRY 基因存在更多的变异位点而在父系进化路途中与其他家牛属物种分歧更早，且彼此由于变异导致明显的分歧进化。

普通牛（Bos taurus）（H12、H13）、瘤牛（Bos indicus）（H11）、斑腾牛（Bos javanicus）（H5）和大额牛（Bos frontalis）（H6）之间在SRY基因存在较少的变异。

本研究克隆了5个麦洼牦牛个体SRY基因序列（1265 bp），并分析了牦牛与其他家牛属动物在该基因序列的变异特征及父系进化关系。

SRY基因由单一外显子构成，所编码蛋白的不同区域性质和功能各有差异，一般认为中部的HMG-box 区域是SRY蛋白发挥功能的关键区域，在进化中比较保守（王晓霞等，2000）。

有研究对几种人猿超科物种之间的比较分析显示SRY基因编码N、C两端（HMG-box侧翼）氨基酸的序列错义突变率高于同义突变率，认为存在微弱的正选择（适应性选择）；而在啮齿类物种间没有此现象（Pamilo等，1997）。

本研究发现在包括普通牛（Bos taurus）、瘤牛（Bos indicus）、斑腾牛（Bos javanicus）、大额牛（Bos frontalis）、牦牛（Bos grunniens）、江河水牛（Bubalus bubalis）和非洲水牛（Syncerus caffer）的家牛属物种中，编码SRY 蛋白N、C两端氨基酸（HMG-box侧翼）基因序列的错义突变率（0.57）显著低于编码HMG-box区域基因序列的错义突变率（0.69），此结果与啮齿类物种间
SRY基因变异现象相似（Pamilo等，1997）。

因此，家牛属物种间在SRY基因
进化过程中的正选择不仅作用于编码HMG-box的基因序列，同样也作用于编码HMG-box侧翼的基因序列，此结果也部分支持了Pamilo等（1997）和王晓霞
等（2000）的观点。

家牛属物种间的父系分子系统树显示，相对江河水牛（Bubalus bubalis）、非洲
水牛（Syncerus caffer）及牦牛（Bos grunniens），欧洲野牛（Bison bonasus）与黄牛的亲缘关系更近，此结果从父系起源侧面支持现存的黄牛牛种由已经灭绝的野牛（auroch）或原牛（Bos primigenius）驯化而来的观点（Epstein等，1984；Payne，1991），而且普通牛（Bos taurus）、瘤牛（Bos indicus）、斑腾牛（Bos javanicus）和大额牛（Bos frontalis）之间具有更近的亲缘关系，由
此也从父系进化侧面印证了斑腾牛和大额牛与黄牛可能有过基因交流的观点（蔡欣等，2007；苟潇等，2009）。

多名学者从mt DNA变异分析牦牛有2个或2个
以上母系来源或有2个主要的驯化地点，与普通牛也有部分基因交流（Lai等，2007；Qi等，2010；Guo等，2006；Wang等，2010），比较而言，本研究
基于10条SRY基因序列发现牦牛有2个或多个父系祖先，但需要进一步扩大牦
牛类群及其样本含量进行深入研究。

非洲水牛（Syncerus caffer）和江河水牛（Bubalus bubalis）与其他牛种之间在SRY基因存在较多变异导致明显的分歧进化，此结果也印证了母系起源进化分析将水牛可划分为沼泽型和江河型2个亚种
且有独立母系起源的论断（Kumar等，2007；Lei等，2007）。

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