实验三 凝胶过滤法分离蛋白质

实验三凝胶过滤法分离蛋白质
【实验目的】
了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。

【基本原理】
凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。

凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。

目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶（商品名是Sephadex）。

这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。

高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。

其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。

当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程所经路程长短不同而得以分离。

由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。

从而按由大到小的顺序流出实现分离的目的。

凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。

凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用途。

在含有血红蛋白（M w=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，M w=327.25）,血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。

为了除去多余的高铁氰化钾，等到较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将MetHb完全分离出来的目的。

【实验试剂、材料和器材】
（一）试剂
（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：
称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，最后定容到1000mL。

（2）0.4% K3Fe（CN）6：
称取0.4g K3Fe（CN）6，溶于100mL蒸馏水中。

（3）生理盐水：0.85~0.9%氯化钠水溶液，置于冰箱中预冷。

（4）四氯化碳（CCl4）
（5）交联葡聚糖（Sephadex-G-25）
（二）材料
动物的抗凝全血
（三）器材
pH计，1.5cm×20cm的层析柱，电子天平，冰箱，试管，容量瓶，量筒，大烧杯，玻璃棒，胶头滴管等
【操作步骤】
1.凝胶溶胀
称取5 g Sephadex-G-25，倾入锥形瓶中，加60mL蒸馏水搅匀后静置，充分溶胀（在室温下约需6h或者在沸水浴中溶胀2h）。

凝胶溶胀后，需要蒸馏水洗涤约3次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出来，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。

洗后将凝胶浸泡在10倍体积的磷酸缓冲液中过夜待用。

2.装柱
取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端出口。

然后从管顶向柱内加入缓冲液约6cm高，将已经溶胀好的Sephadex-G-25搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex-G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右床面上覆盖3mL缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，待凝胶柱形成后，在洗脱液中加入磷酸盐缓冲溶液以2~3倍体积的磷酸盐缓冲液流过凝胶柱，以平衡凝胶，最后关闭出口。

3.样品处理
（1）血红蛋白溶液的制备
取草酸盐抗凝全血3mL离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。

最后一次吸去上清液后在红细胞层上面加等体积蒸馏水，摇匀。

再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3000r/min离心5min。

吸取上层澄清的血红蛋白液备用。

此溶液中血红蛋白浓度约为10%（置4℃暂存，一周用完）
（2）样品
血红蛋白液、0.4% K3Fe（CN）6和蒸馏水按照3:8:2混合，制成MetHb混合样品。

3.上样和过滤
凝胶平衡后，用胶头滴管除去凝胶柱面的溶液。

吸混合样品0.5mL左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加样品，切勿搅动床面。

然后打开柱下口，控制流速让样品溶液慢慢浸入凝胶内。

凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲溶液，并用1~2倍体积的此缓冲液洗脱，但注意切勿搅动床面凝胶。

4.部分收集
控制流速为0.5mL/min左右（即约每六秒一滴），用试管收集洗脱液。

并观察柱上的色带，待黄色的0.4% K3Fe（CN）6完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为对照，关闭出口。

5.凝胶回收
收集样品后，凝胶柱可用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，即可重复使用或回收凝胶。

凝胶暂时不用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。

若放在室温下保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。

用时以水洗去防腐剂即可用。

凝胶长期不用，可用水洗涤，分次加百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换下一浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。

【思考题】
1.利用凝胶层析分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？
2.凝胶过滤法在蛋白质分析中还有何应用？。