抗氧化酶SOD、POD、CAT活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法
一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化复原法）
1、试剂的配制
1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；
母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)
21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参照文件：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育第一版社，2000：267～268。

2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保留。

5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保留。

酶液制备：取0.2g（可视状况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定
1）反响混淆液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，
磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混淆后摇匀；
（2）分别取3ml反响混淆液和30μl酶液于试管中
光照下反响
（3）将试管置于光照培育箱中
在4000lux
20min；
同时做两支比较管，此
中后测定作为最大光复原管，
1支试管取3ml反响混淆液加入30μlPBS（不加酶液）照光另
1支只加缓冲液置于暗中测准时用于调零。

（4）以不照光的比较管（只有缓冲液并置于暗
处）
OD560(出现颜色即
调零后，避光
测
可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以克制NBT光化复原50％所需酶量（测的样品值要
在最大管的一半左右才适合，不然要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；
A ck为照光比较管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液整体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测准时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测准时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。

二、POD、CAT酶活性的测定
粗酶液制备同SOD。

1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4)123ml和B母液(NaH2PO4)877ml
混匀即为1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反响混淆液配制（以60个样为准）：
取200mlPBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热
搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30％的H2O2，混匀后保留于冰箱中备用。

（3）样品测定：
取3ml反响液并加入30μl酶液，以PBS为比较调零，尔后测定OD470值（测定40秒）。

（边加样边测定，测定前等候5秒，动作要快，假如慢的话，要保证每个样品从加好样到开
始记时的时间相差不大）
（4）酶活性计算：以每minOD值变化（高升）0.01为1个酶活性单位（u）。

POD=（A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)
A470：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(min)；Vt为提
取酶液整体积（ml，(1.6ml）；Vs为测准时取用酶液体积（ml，30ul）。

2、过氧化氢酶（ CAT）活性测定
（1）试剂配制：
0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5
ml混淆后用蒸馏水定容至1000ml。

（2）反响液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。

测
定
（3）样品测定：取 3ml反响液加入
OD240（紫外）（测定40s）。

0.1ml（可视状况调整）酶液，
以
PBS为比较调零，
（4）酶活性计算：以
每
minOD值减
少0.01
为
1个酶活性单位
（
u）。

CAT=[
A240×Vt
（]/W×Vs×0.01×
t）
(u/gmin)
A240：为反响时间内吸光度的变
化；
W为样品鲜重(g)；
t 为反响时
间
(min)；
Vt
为提
取酶液整体积
（
ml， 1.6ml）；
Vs 为测准时取用酶液体积
（
ml,0.1ml）。

四、超氧阴离子自由基（ O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）
1、试剂的配制
（1）1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容
至300ml；
（2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取 1.1776g对氨基苯磺酸用少许冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；
（3）7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋
酸：水=3：1配制）定容至400ml。

2、O2.-含量的测定
（1）样品液提取方法同SOD测定；
（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视状况调整用量）中加入0.5mlPBS（0.05M，pH7.8），
1ml1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。

3）在25℃下保温1小时；
4）挨次先加入1ml17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml7mMα-萘胺，混淆后迅速摇匀；
5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后立刻进行测定（或置于冰箱待测）；
6）以比较管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；
（7）O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2-标准曲线获得[NO2-]；依据羟胺与O2.-
的反响式：NH2OH＋2O2.-＋H+NO2-＋H2O2＋H2O计算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再
依据样品与羟胺反响的时间和样品中的蛋白质含
量，求得O2.-产生速率（以nmolmin-1mg-1蛋白表示，也能够nmolmin-1g-1鲜重表示）。

.-
×W）（nmolmin -
1-1
鲜重）
O2产生速率=（C×V）/（t g
C为标准曲线上查得的浓度
(umol/L)；V为测准时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体
积)；t为反响时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实质
质量g)
参照文件：王爱国，罗广华．植物生理学通
信，1990，（6）：55～57
五、丙二醛含量的测定
1、试剂配制：
10%TCA：100g三氯乙酸→1L
0.67%TBA：3.35g
硫代巴比妥
酸
→500ml10%TCA（避光）
2、测定步
骤
:
0.2 样品+1.6ml10%TCA
研磨→12000g离
心10min→上
清
1.5ml+1.50.67%TBA→开水
煮30min→冷却，离心→上清OD450，OD532，OD600
3、计算组织中 MDA含量：
MDA浓度C(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450
MDA含量(umol/gFW)=C×V/W
式中V为提取液体积(1.6ml) ，W为样品鲜重(0.2g) 。

六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）
1）取新鲜叶片或根系（不可以萎蔫）0.3g，用自来水冲刷表面污渍，再用去离子水冲刷几遍后用吸水纸吸干水分；
（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在
室温下搁置3h使叶片充足吸水后测定溶液电导率(R1)；
3）再放入恒温水浴锅中在100℃开水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；
4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：
相对电导率（%）=R1/R2×100%
还能够计算植株损害程度：
损害率=（办理电导率—比较电导率）/（煮沸电导率—比较电导率）×100%
七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）
1、试剂的配制
（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100mg考马斯亮蓝，溶于50ml90％乙醇中，加入100ml85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。

在留宿后过滤并贮于棕色瓶中，常温
下可在暗中保留一个月。

（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mgBSA加水溶解后定容至
再从中汲取40ml用蒸馏水定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml 即为
标准BSA溶液）。

100ml，100μg/ml
2、样品可溶性蛋白含量的测定
（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷
酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反响2min后测OD595
（以100μl缓冲液加 2.9ml考马斯亮蓝为比较调零）。

（2）蛋白质含量计算：
可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×V T)/(W×V S×1000)
C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；V T为提取液整体积（稀释后的体积ml）；V S
为测准时所用提取液体积
（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。