文档：盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白

盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白(选学)
【目的和要求】
1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。

2.学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，包括制胶、灌胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。

3.了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，利用盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质和血清球蛋白-血清清蛋白-铁氧还原蛋白的混合液。

【实验原理】
盘状聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。

改变单体的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，将次凝胶灌装于直立的玻璃管中，再加样品，进行电泳分离，称为盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。

一般常采用7.5%的盘状聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，2.4%的分离核酸。

盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳
不连续的凝胶电泳亦可称为盘状电泳。

在这种电泳过程中，除去一般的电荷效应外，还有两种物理效应：
（1）凝胶对样品分子的筛选效应：颗粒小，形状为圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大形状不规则的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力较大，移动较慢。

（2）不连续系统对样品的浓缩效应：高度的浓缩效应，大大提高电泳分离的分辨率，特别适用于稀浓度的样品的分离。

【实验试剂与仪器】
试剂：新鲜不溶血的动物细胞，凝胶缓冲液（pH=8.9），分离胶缓冲液（28%Acr-0.735%Bis），浓缩胶缓冲液（pH=6.7），浓缩胶贮液，过硫酸铵溶液（当天用当天配置），核黄素铵溶液，40%蔗糖溶液，Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3），0.1%溴酚蓝指示剂，染色液，脱色液。

仪器：常压电泳仪；圆盘电泳槽；玻璃管（内径约0.5cm～0.7cm，长度约8 cm～10cm）；有机玻璃架（或自制木头架）；微量进样（100μl）器；5ml注射器；长、短注射针头；
长、短颈滴管；日光灯或100w白炽灯；乳胶管；玻璃球（或小段玻璃棒）；培养皿；
烧杯；洗耳球。

【实验步骤】
1.安装圆形玻管
2.取玻璃管洗净烘干后将其下端口用parafilm三层或橡胶玻璃头封严，然后垂直安装在
试管架上备用，或直接插于电泳槽内。

配胶
分离胶的配置比例为pH8.9的分离胶缓冲液2.50ml，28%凝胶贮液5.00ml，重蒸馏水2.50ml，0.14%AP10ml。

加AP前需要充分混匀，放置与真空干燥器中抽气10min。

分离胶的终浓度为7%，终体积为8ml。

浓缩胶的配法：取浓缩胶缓冲液（pH6.7）1ml，浓缩胶贮液2ml，40%的蔗糖4ml，0.004%核黄素铵溶液1ml，加核黄素溶液前需要充分混匀，放置与真空干燥器中抽气10min。

所配浓缩胶浓度为2.5%，终体积为8ml。

3.灌胶
不连续体系凝胶的灌注分两步。

分离胶的制备：混合好的凝胶溶液用细长头滴管加至准备好的玻璃管内，加胶高度距上端口2cm左右，用1ml注射器在凝胶表面轻轻加一层重蒸馏水（沿管壁），约3~5mm，用于隔绝空气，使胶面平整。

30~60min后凝胶完全聚合，此时可见水与凝胶面有折射率不同的界线出现。

用滤纸条吸去多余水分，勿碰胶面。

浓缩胶的制备：混合好的凝胶溶液用细长头的滴管加到分离胶的上面，使其液面距上端约0.5cm，然后置于日光灯（约10cm远）或阳光下照射进行光聚合。

注意温度不能太高，凝胶由淡黄色变为乳白色表明聚合作用开始，继续光照半小时，聚合即可完成。

然后继续放置30~60min，用滤纸条吸去多余水分。

4.加样，电泳
将制备好的凝胶玻璃管插入圆盘电泳槽上，加少量电极缓冲液检查一下是否有渗漏现象，若有解决之。

然后在上下极槽内加入适量的电极缓冲液，使上下极电路畅通，然后加血清蛋白样液5~10ul，加样时用微量注射器将样液通过缓冲液小心的加在凝胶表面，将所有玻璃管内均加完样品后即可开始电泳。

按照上槽接负极，下槽接正极的方式接在直流稳压电泳仪上，开始电泳，电流约1mA/管，当样品进入分离胶时，将电流调到3mA/管。

当染料移至距下端
保存，还可再用。

1cm时，将电流调回至零，关电源。

分别收集上下极槽电泳缓冲液，4 C
5.固定染色
取出玻璃管，用注射器吸满自来水后将长针头插到凝胶与管壁之间，推动注射器，同时转动玻璃管，使针头在管壁与胶之间前进，胶条在水的压力及滑润作用下自玻璃管中脱出。

然后将干净的胶条浸泡在染色液中，染色10min，同时也进行了固定。

6．脱色
用水冲去胶条表面染料，置于脱色剂中浸泡漂洗，更换漂洗液数次，直到背景色脱去。

【主意事项】
1、贮液放冰箱中一般可保持1～2个月，但3号贮液只能保存一周。

如有不溶物可过滤。

2、Acr和Bis对神经系统有毒害，使用时要小心，注意勿与皮肤接触。

但聚合后的凝胶对人体无害。

3、电泳时的电流最好不超过5mA/管，以免产生过多热量。

室温高时应进行冷却或冷库内进行电泳。

4、本实验需时间较长。

在一次实验中可安排到脱色一步，再于下一次实验中观察脱色后的胶条并绘图。

5、在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合速度与Ap浓度平方根成正比，一般在室温下，pH8.8时，7.5%丙烯酰胺溶液30min完成聚合作用，在pH4.3时聚合速度很低，约需90min才能聚合，此外应选择高纯度的Acr和Bis。

杂质。

某些金属离子、低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。

【思考问题】
1.影响聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白实验结果的因素有哪些？
2.聚丙烯酰胺凝胶不聚合的主要原因是什么？如何克服？
3.为什么要在样品中加少许溴酚蓝和一定浓度的甘油？。