SOD活性的测定

SOD活性的测定
一、酶液的制备：
称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4℃冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

二、S OD的测定：
1.SOD反应液的配制：
母液的配制：
（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;
(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现
用。

（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；现配现用,避光保存。

(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，同上
(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。

避光保存。

同上
SOD反应混液：
磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例为1.5：0.3：0.3：0.3：0.25，按母液顺序配制，然后依次加入核黄素0.3ml和酶液50微升。

2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取50微升的酶液，4000Lux照光30分钟，同时取
两支试管，一支做对照，一支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存，以
空白调零，560nm比色。

每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照）
3.结果计算
SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5 ×Vt×A CK）
单位：NBT光还原50%为单位
SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；
A ck为照光对照管的吸光度；A E为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。

注意：1.要10ml离心管，不要大试管，否则枪头够不着，不好吸；
2．提取液预冷；
3. 测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量
4.照光时间和强度严格控制，试管要透明，质地均一。

三、磷酸缓冲液的配制：
A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21克，用蒸馏水定容
至1000毫升。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克，用蒸馏水定容
至1000毫升。