第五章灭菌——精选推荐

第五章灭菌
第五章灭菌
污染杂菌的危害
1.消耗营养物质。

2.抑制发酵菌⽣长。

3.改变培养液理化性质。

4.抑制产物⽣物合成。

5.噬菌体污染。

第⼀节灭菌的基本原理
⼀、灭菌定义
指⽤化学的或物理学的⽅法杀灭或除掉物料或设备中所有的有⽣命的有机体的技术或⼯艺过程。

⼆、常⽤灭菌⽅法
1.化学物质灭菌
利⽤化学试剂（甲醛、苯酚、⾼锰酸钾等）与微⽣物细胞中某种化学成分反应，如使蛋⽩质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性等杀灭微⽣物。

应⽤：实验室和⽆菌室的空间灭菌，设备、器械、双⼿的消毒灭菌，但不能⽤于培养基的灭菌。

2.辐射灭菌
原理：利⽤⾼能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微⽣物
常⽤：紫外线、X 射线和γ射线
紫外线：诱导了胸腺嘧啶⼆聚体的形成和DNA 链的交联，从⽽抑制了DNA 的复制，导致菌体
死亡。

波长为260nm 的杀菌⼒最强穿透⼒差。

应⽤：适于表⾯灭菌。

⽆菌室、接种箱
3.⼲热灭菌
在⼲燥⾼温条件下，微⽣物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，是微⽣物的致死率迅速增⾼的过程。

常⽤⽅法：灼烧和电热箱加热，160℃ 2⼩时发酵的流程
空⽓空⽓净化处理
保藏菌种斜⾯活化扩⼤培养
主发酵
碳源、氮源、⽆机盐等营养物质
灭菌
成品
使⽤范围：需要保持⼲燥的器械、容器的灭菌。

玻璃及⾦属⽤具及沙⼟管灭菌
4.过滤除菌
原理：利⽤微⽣物不能透过滤膜⽽达到除菌⽬的。

⽅法: 0.01~0.45 m孔径滤膜，
使⽤范围：⽤于压缩空⽓、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

5.湿热灭菌
由于蒸汽具有很强的穿透⼒，冷凝时可释放出⼤量潜热，且在⾼温有⽔分条件下，蛋⽩质易变性，使微⽣物死亡。

常⽤⽅法：
⽔煮常压灭菌：100℃，40-60min
⾼压蒸汽灭菌：⼀般121℃，30分钟
使⽤范围：培养基和发酵设备灭菌。

湿热灭菌的优点：
蒸汽有强的穿透⼒，灭菌易于彻底；
蒸汽来源容易，操作费⽤低，本⾝⽆毒；
操作⽅便，易管理。

三、湿热灭菌的理论基础
1.灭菌指标的确定
⼤多数微⽣物最适温度为25~27℃,维持温度为5~50℃，当温度超过最⾼限温时微⽣物就会发⽣死亡。

⽆芽孢菌在60℃保温10min即可全部被杀死。

芽孢要在100℃下保温10min到⼏⼩时才能被杀死。

嗜热细菌在120℃下仍可耐受20~30min。

致死温度：杀死微⽣物的极限温度称为致死温度。

致死时间：在致死温度下，杀死全部微⽣物所需要的时间。

热阻：指微⽣物在某⼀种特定条件下（主要是温度和加热⽅式）的致死时间，它代表了微⽣物对热的抵抗能⼒。

相对热阻：是指某⼀微⽣物在某条件下的致死时间与另⼀微⽣物在相同条件下的致死时间的⽐值。

⼀般所指的灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻⼤的芽孢杆菌为指标。

2.微⽣物的热灭死定律——对数残留定律
对数残留定律：在灭菌过程中，微⽣物个数减少速率(dN/dt)与⼀瞬间残留的活菌数成正⽐。

（书本P82 公式5-1 5-2 5-3）
实际设计时常⽤Nt＝0.001即1000批次的灭菌中只有⼀批失败。

3.反应速率常数K
反应速度常数K是判断微⽣物耐热性的⼀种依据。

相同条件下，不同微⽣物的K值是不同的。

K值越⼩，热阻越⼤。

同⼀微⽣物在不同温度下，K值不同。

温度越⾼，K值越⼤，灭菌时间越短
第⼆节培养基和发酵设备的灭菌
⼀、培养基的灭菌温度选择
绝⼤多数培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都属于⼀级动⼒学反应。

阿累尼乌斯⽅程（书本P84 公式5-6 5-9 5-11）
随温度的升⾼，灭菌反应速度常数增加的倍数⼤于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。

Q10：温度升⾼10℃时的反应速度常数与原温度时的反应速度常数的⽐值。

⼀般的化学反应Q10为：1.5~2.1
杀灭微⽣物营养体的反应Q10为：5~10
杀死芽孢时的反应Q10为：35
⼆、培养基灭菌⼯艺
⼯业上：分批灭菌、连续灭菌
（⼀）分批灭菌
定义：将配制好的培养基输⼊发酵罐中，⽤直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压⼒后维持⼀定时间，再冷却⾄发酵要求的温度，这⼀⼯艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。

1．操作过程：
空罐准备：清洗、检修和检测。

升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。

（预热）
保温维持：在灭菌温度（120℃）下保持30分钟。

冷却保压：把培养基的温度快速降低到接种的温度。

2、分批灭菌设备⽰意图
三路进汽：蒸汽从通风、取样和出料⼝进⼊罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持⼀定的时间。

这就是所谓的“三路进⽓”
四路出汽：直接蒸汽从排⽓、接种、进料和消沫剂管排⽓
优点：不需要其他附属设备，操作简便
缺点：加热和冷却时间较长，营养成分有损失；不能采⽤⾼温快速灭菌⼯艺；罐利⽤率低。

（⼆）连续灭菌
定义：培养基在发酵罐外经过⼀套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送⼊已灭菌的发酵罐内的⼯艺过程。

1.由热交换器组成的连续灭菌系统
含淀粉培养基须⽤酸或酶⽔解后再⽤连续灭菌
1mm悬浮颗粒须增加1s，1cm须增加100s，所以培养基中颗粒＜2mm
2.蒸汽直接加热培养基的连续灭菌系统
由于冷凝，培养基被稀释，由于粘度的变化。

3.由连消塔、维持罐和冷却器组成的连续灭菌系统（书本P88 图5-6）
控制培养基输⼊连消塔的速度＜0.1m/min，灭菌温度为132℃，在塔内的停留时间为20-30秒。

优点：
1.可采⽤⾼温快速灭菌⼯艺，营养成分破坏少。

2.发酵罐⾮⽣产占⽤时间少，容积利⽤率⾼。

3.⾃动化，热能利⽤率合理。

缺点：
1.不适⽤于粘度⼤和固形物含量⾼的培养基。

2.增加设备、操作环节以及染菌机率。

（三）连续灭菌与分批灭菌的⽐较与选择
分批灭菌
优点：
1．不需附加设备2．蒸汽利⽤率⾼3．节约劳动⼒
缺点
1．培养基质量⽐较差2．罐的利⽤率低3. 冷却⽔⽤量⼤
连续灭菌
优点：
1. 采⽤⾼温快速灭菌法2．可以把培养基按其性质分开灭菌3．有利于⾃动控制
4．节省冷却⽔
缺点
1．投资费⽤⾼2．对物料要求⾼3．蒸汽⽤量⼤
（四）⾼温对培养基成分的有害影响
（五）消除⾼温有害影响的措施
（1）采⽤特殊加热灭菌法(连续灭菌⽅法）
（2）对易破坏的含糖培养基进⾏灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；
（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；
（4）对含有在⾼温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进⾏低压灭菌
三、发酵设备的灭菌
实罐灭菌：发酵罐与培养基⼀起灭菌；
连续灭菌：发酵罐在培养基灭菌之前，直接⽤蒸汽进⾏灭菌.空消之后不能⽴即冷却；
发酵罐附属设备灭菌：分空⽓过滤器、补料系统、消沫剂系统等
第三节空⽓除菌
⼀、概述
1. ⽆菌空⽓的概念
通过除菌处理使空⽓中含菌量降低在⼀个极低的百分数，从⽽能控制发酵污染⾄极⼩机会。

此种空⽓称为“⽆菌空⽓”。

2.发酵对空⽓⽆菌程度的要求
各种不同的发酵过程，对空⽓⽆菌程度的要求也不同，需要根据具体情况⽽订出具体的⼯艺要求。

⼀般要求1000次使⽤周期中只允许有⼀个菌通过，即经过滤后空⽓的⽆菌程度为N=10-3。

空⽓中微⽣物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量⼀般为103 ~ 104个／⽶3。

⼀般附着在空⽓中的灰尘上或雾滴上。

灰尘粒⼦的平均⼤⼩约0.6µm左右，空⽓除菌主要去除空⽓中的微粒(0.6~1µm）。

3.空⽓除菌的⽅法：
加热灭菌(蒸汽、电能、空⽓压缩）、静电除菌、辐射灭菌、化学灭菌、介质过滤除菌加热灭菌
利⽤压缩热进⾏空⽓灭菌的流程图（书本P90 图5-7）
空⽓进⼝温度为21℃，出⼝温度为187~198℃，
压⼒为0.7MPa。

静电除菌
1，原理
利⽤静电引⼒来吸附带电粒⼦⽽达到除尘、除菌的⽬的。

2，优点
阻⼒⼩，约1.01325×104Pa ；
除⽔、除油的效果好；
耗电少。

3，缺点
捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施；
设备庞⼤；
⼀次性投资较⼤；
⼆、介质过滤除菌机理
过滤除菌：利⽤有孔介质从⽓体中除去微⽣物
过滤器经常被认为是⼀种简单的⽹或筛⼦，过滤 / 分离是在⼀个平⾯上进⾏的。

实际上，空⽓过滤器的滤材具有深度：“弯曲通道”的结果对于污染物的去除起到了辅助作⽤。

原理：
过滤介质填充到过滤器中，空⽓流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散等作⽤将尘埃微⽣物截留在介质中，达到除菌的⽬的。

直接拦截
绝对截留 - 颗粒被捕获在滤材纤维之间形成的孔中
惯性撞击
当流体改变运动⽅向时，惯性使颗粒撞击到滤材表⾯并由于吸附⼒⽽停留
扩散拦截
分散在⽓体分⼦中的⼩颗粒或雾滴受到撞击发⽣位移
被随机运动的⽓体分⼦碰撞的颗粒撞击到过滤介质上并被吸附截留
过滤介质的过滤 / 分离效率由于直接拦截惯性撞击扩散拦截的共同作⽤⽽增强
三、空⽓过滤介质：
空⽓过滤介质不仅要求除菌效率⾼，⽽且还要求能耐受⾼温⾼压，不易被油⽔污染、阻⼒⼩、成本低、易更换。

表⾯过滤介质:编织⽹粉末烧结
深度过滤介质:纤维材料结构棉花活性炭或玻璃纤维有机合成纤维⼦弹状膜过滤
四、空⽓过滤除菌的⼯艺流程
1.冷热空⽓直接混合式空⽓过滤除菌流程
适⽤于中等混合量的地区。

2.两级冷却、分离、加热的空⽓过滤除菌流程
流程的特点是：两次冷却，两次分离，适当加热。

（常⽤）
旋风分离器——利⽤离⼼⼒进⾏沉降，对于10µm以上的微粒分离效率较⾼。

丝⽹分离器——利⽤惯性进⾏拦截，分离效率较⾼，能除去2～5µm的细⼩颗粒。

3.⾼效前置过滤除菌流程
特点：⽆菌程度⾼
4.空⽓的预处理
提⾼压缩前空⽓的洁净度
去除压缩后空⽓中的油和⽔
1）提⾼压缩前空⽓的洁净度
提⾼空⽓吸⽓⼝的位置
在空⽓⼊⼝处设置粗过滤器
——捕集较⼤的灰尘颗粒，并保护空压机
⾼空取⽓管
为远离地⾯⼏⼗⽶的管⼦。

每升⾼10⽶，空⽓中杂菌降低⼀个数量级。

因此从⾼空取⽓要⽐从低空取⽓有利得多。

2）去除压缩后空⽓中的油和⽔
储⽓罐中除去⼤的⽔滴和油滴
分离器（旋风和丝⽹）
3）压缩后空⽓温度显著上升，需冷却。

压缩后的⾼温空⽓能引起过滤介质的炭化或燃烧
增⼤发酵罐的降温负荷
增加培养液⽔分的蒸发
第四节⽆菌检查与染菌处理
⼀、⽆菌检查
三⽅⾯进⾏分析：⽆菌试验、培养液的显微镜检查、培养液的⽣化指标变化情况。

（⼀）⽆菌试验
1.⾁汤培养法
2.斜⾯培养法
3.双碟培养法
（⼆）染菌的判断
1.连续3个时间的酚红⾁汤⽆菌样发⽣颜⾊变化或浑浊。

双碟上连续3个时间样品长出杂菌
检查样品保留，以备长期监测。

⼀般保留⾄放罐后12⼩时。

2.溶解氧⽔平异常变化显⽰染菌
3.排⽓中CO2异常变化显⽰染菌
⼯艺⼀定，尾⽓中CO2量变化有⼀定规律
污染杂菌，糖耗加快，尾⽓中CO2量增加
污染噬菌体，糖耗减慢，尾⽓中CO2量减少
⼆、染菌的处理
（⼀）污染杂菌的处理
1.种⼦罐的处理
直接灭菌后废弃
2.发酵罐的处理
前期染菌：如危害性⼤,采⽤蒸汽灭菌经过滤处理后放掉;如果危害性不⼤,可⽤重新灭菌、重新接种的⽅式处理。

中后期染菌：加⼊适量的灭菌剂（抗⽣素）；降低培养温度或控制补料量来控制杂菌的⽣长速度。

3.染菌后设备的处理
⽤甲醛等化学物质处理,再⽤蒸汽灭菌〈包括各种附属设备〉。

在再次投料之前,要彻底清洗罐体、附件,同时进⾏严密程度检查,以防渗漏。

（⼆）污染噬箘体的处理
1.噬菌体
利⽤细菌或放线菌进⾏的发酵容易感染噬菌体。

噬菌体是病毒的⼀种，直径约0.1微⽶，可以通过细菌过滤器，所以通⽤的空⽓过滤器不易将其除去。

2.污染噬菌体的判断
噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀
在较短时间内菌体⼤量⾃溶,最后仅残留菌丝断⽚
平⽫培养出现典型的噬菌斑
溶氧浓度回升提前
营养成分很少消耗,产物合成停⽌等现象。

有⽆染噬菌体，根本的要做噬菌斑检验
3.污染噬菌体的处理办法
1.发酵液⽤⾼压蒸汽灭菌后放掉,严防发酵液任意流失；
2.全部停产,对环境进⾏全⾯的清洗和消毒,断绝噬菌体的寄⽣基础；
3.更换⽣产菌种,不断筛选抗噬菌体菌种,防⽌噬菌体的重复污染。

第五节制服染菌的要点
⼀、染菌原因的分析
1.染菌规模分析
⼤规模染菌
空⽓净化系统、空⽓管道渗漏
种⼦染菌
部分罐批染菌
某⼀批号种⼦染菌
某⼀套连消系统染菌
补料管路渗漏或补料液带菌
个别罐批连批染菌
设备问题
个别罐不连批染菌
培养基灭菌不彻底或操作失误
2.染菌时间分析
早期染菌
培养基灭菌不彻底
种⼦带菌
接种管道灭菌不彻底或接种操作不当
中期后期染菌
培养基灭菌不彻底
加消沫剂、补料系统灭菌不彻底或渗漏
发酵设备渗漏
泡沫顶罐
3.染菌菌型分析
耐热的芽孢杆菌：
培养基灭菌不彻底
设备内部有死⾓
霉菌：
种⼦室、摇瓶间、搅拌轴封、被倒流的空⽓介质、空⽓
不耐热的球菌或杆菌：
空⽓系统、冷⽔设备渗漏
⼆、制服染菌的要点
1.对空⽓净化系统的要求：提⾼空⽓进⼝的空⽓洁净度；除尽压缩空⽓中夹带的油和⽔,保持过滤介质的除菌效率。

2.对蒸汽的要求：⼀般采⽤饱和蒸汽,严格控制蒸汽中的含⽔量,按照不同灭茵⼯艺要求提供稳定的蒸汽压⼒,灭菌过程中蒸汽压⼒不可以⼤幅度的波动,
3.对设备的要求：发酵罐及其附属设备应做到⽆“渗漏”,⽆“死⾓”。

4.对⼯艺操作的要求：放罐检修，灭菌要彻底，种⼦，操作，空⽓补料
概念
灭菌辐射灭菌致死温度致死时间热阻相对热阻分批灭菌连续灭菌介质过滤除菌
要点
了解常⽤的灭菌⽅法及相关原理
分批灭菌的操作过程
根据设备不同，可将连续灭菌⼯艺分为哪三类
空⽓过滤除菌的机制主要有哪三种？
提⾼压缩前空⽓洁净度的措施有哪些？
去除压缩后空⽓中的油和⽔的措施有哪些？
空⽓压缩后需冷却的原因
培养液是否染菌的分析⽅法有哪些？其中判断染菌的主要依据是那种⽅法？发酵过程中染菌的处理⽅法（作业）
发酵过程中染菌原因的分析
了解制服染菌的要点。