分子生物学的基本操作

Plasmid pSC101
Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline E. coli transformed with recombinant plasmid
Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies
5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背 景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。
1.3 基因扩增
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)， 即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其 特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由 高温变性—低温退火—适温延伸三个基本反应步骤构成， 经多个循环，理论上靶DNA分子将呈现指数性扩增。
Heat killed S cells mixed with living R cells Living S cells in blood sample from dead mouse
Results
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复 制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae
Living St killed S cells
Bacterial Strain Injection
PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
鸟嘌呤核苷
如果是存在于DNA中的脱氧核苷则2’位则是H而不是OH。
磷 酸
+ 戊糖
+ 碱基
=
核苷酸
NH 2 N
O HO O P HO OH
NH2 N O O
-
CH2 CH 2
O O
N
O
N N N H H
OH OH OH OH
O O
-
O O
-
P O
-
P O
-
P O
-
OCH2 H H
O
OH OH 三 磷 酸 腺 苷 (AT P )
PCR Cycle - Step 3 -
At 72oC Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物结 合物在TaqDNA聚 合酶的作用下，以 dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按 碱基配对与半保留 复制原理，合成一 条新的互补 链。
Herbert Boyer
表明： （1）像pSC101这样的质粒DNA分子可以作 为基因克隆的载体，从而把外源DNA导入 寄主细胞；
（2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因 也可以被成功地转移到原核细胞中并实现 其功能表达；
（3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一种成 功的基因克隆体系，有可能在重组DNA或 基因工程研究中发挥重要作用。
Rosalind Franklin
Photographic film
X-ray source Crystallized DNA
Maurice Wilkins
1953- Franklin & Wilkins
Description of the structure of DNA
Francis Crick & James Watson
Ligase
5’
3’
Restriction enzyme Ligase
限制酶的发现——细菌的限制与修饰现象
重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶 类 功 能
限制性核酸内切酶(II型) DNA连接酶 DNA聚合酶I（大肠杆菌） 反转录酶 多核苷酸激酶 末端转移酶 DNA外切酶III λ 噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶 识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子 按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标 记实验或用来进行DNA的连接 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸 从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸 从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
核苷酸的连接方式
核苷酸之间以磷酸二
酯键连接形成多核苷
酸链，即核酸。
两大技术保证：
1.DNA的体外切割和连接
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶 DNA ligase covalently links two DNA strands
3’
5’
Restriction enzyme
分子克隆的载体---具备自主复制 能力的DNA分子 （vector），如 病毒、噬菌体和 质粒等小分子量 复制子都可以作 为基因导入的载 体。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后， 能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样 能够摄取质粒DNA。
处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。
感受态 细胞制 备及细 菌转化 步骤：
1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中， 便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。
2.Ca2+与转化混合物中的外源DNA形成粘 附在细胞表面的复合物。 3.立即将该体系转移到42℃下做短暂的 热刺激，复合物便会被细胞所吸收。 4.在全培养基中生长一段时间使转化基 因实现表达、细胞活性恢复。 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。
1972 - Paul Berg,
Produced first recombinant DNA using EcoRI
EcoRI recognition sites
λ phage DNA
EcoRI cuts DNA into fragments
Sticky end The two fragments stick together by base pairing
General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中，分 离出带有目的基因的DNA片段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接 到能够自我复制的并具有选择记号的载 体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体 细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增 殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获 得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出 已经得到扩增的目的基因。
1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway
Parent cell
First replication
Frank Stahl
外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍
与性状表达的过程. 基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有 跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于 毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。
1.1 重组DNA发展史------三大成就 ：
1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是 DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
核酸 （RNA、DNA）
磷酸 核苷酸 核苷
核糖（RNA）
戊糖
脱氧核糖（DNA）
A、G、C、U
碱基
A、G、C、T
戊糖
碱 基
嘌 呤
N 7 8 9 NH 5 4 6 3 N 1N 2
腺 嘌 呤
鸟 嘌 呤
嘧
5 4 6 1 NH 3 2
啶
N
尿嘧啶
胞嘧啶
胸腺嘧啶
核 苷
NH2 N N HOCH2 H H OH O H H OH 腺嘌呤核苷 N N N H2N N N HOCH2 O H H H OH H OH OH N HO HOCH2 H H OH O H H OH 胞嘧啶核苷 H OH N N HO HOCH2 H O H H OH 尿嘧啶核苷 NH2 N N OH
Second replication
Conservative Model
Matt Meselson
Semiconservative Model
3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成 功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
Jacob and Monod
知识回顾——核酸的化学组成
PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
1973 - Boyer, Cohen & Chang
Transform E. coli with recombinant plasmid
Kanamycin resistance gene Stanley Cohen & Annie Chan Tetracycline resistance gene
2.DNA的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基 础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术， 对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆 DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。
1.2 细菌转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种 细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。 提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌 菌株则被称为受体菌株。
SV40 DNA
Recombinant DNA
DNA ligase
仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行 DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量 和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力 的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆 。
第一章 分子生物学的基本操作
分子生物学研究从20世纪中叶开始高速发展的 最主要原因—— 现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和 基因工程技术的进步。
DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 基因操作 细胞转化 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定点突变
PCR扩增

基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒 或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之 进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续 稳定的繁殖和表达。
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一个
循环需2～4 分钟， 2～3 小时就能将 待扩目的基 因扩增放大 几百万倍。
Target Amplification
No. of
1 cycle = 2 Amplicon
No. Amplicon Cycles Copies of Target
2 cycle = 4 Amplicon
1 2 3 4 5
2 4 8 16 32 64 1,048,576
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon