蛋白互作研究方法PPT课件
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1）GAL4体系的缺点
2) MbSUS 体系
最新课件
18
mbSUS 原理
最新课件
19
最新课件
20
In vivo cloning into mbSUS vectors
GATEWAY cloning method
最新课件
21
最新课件
22
最新课件
23
最新课件
24
最新课件
25
最新课件
26
最新课件
P = Prey Protein, M = MagneG最S新T.课P件article.
33
5 免疫共沉淀Co-IP
最新课件
34
最新课件
35
最新课件
36
6 Far-western analysis
最新课件
37
7 双分子荧光互补技术 BiFC
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC) 分析技术，利用绿色荧光 蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突变体 (YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割 成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋 白连接. 如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近， 就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近， 重新形成活性的荧光基团而发出荧光. 在荧光显微镜 下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用， 并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互 作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体 的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等， 这些信息对研究蛋白质相最互新课作件 用有一定意义。 38
最新课件
41
GFP及其各种突变体的片段互补特性
最新课件
42
Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation
最新课件
43
Detection of protein–protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation
最新课件
40
GFP 的一些定点突变能明显地改变其波长性质. 产生 的突变体,具有产生多色光的特性，如：GFP66 位的 酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyan fluorescence protein，CFP)，203 位的苏氨酸突 变为酪氨酸后成黄色荧光蛋白(yellow fluorescence protein，YFP)，145 位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成 蓝色荧光蛋白(blue fluorescence protein， BFP) [3]. 2002 年Hu 等[1] 最先报道了用BiFC技术在活细 胞中观察bZIP 和Rel 家族蛋白的相互作用，利用的 就是YFP 作标记，在荧光显微镜下用525 nm 波长 直接检测黄色荧光.
Principle of the BiFC assay
最新课件
39
GFP的特性
绿色荧光蛋白(GFP) 来源于水母(Aequorea victoria)，分子质量约为27 kda，能在各种细胞中表 达. 受到激发时，不需要任何辅助因子，就能在活体 中发出绿色荧光. 1992 年，Prasher 等[2]克隆了GFP 基因. 随后，GFP 作为一种研究基因表达和蛋白质定 位的活体可遗传标记，在各种类型细胞的研究中得到 了广泛的应用.
用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每
个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,
构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,
对于蛋白质相互作用interactome的研究就
成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。
最新课件
2
2 蛋白质相互作用常用研究方法
1 酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)
2 pull-down
3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)
4 双分子荧光互补技术(Biomolecular fluorescence complementation,BiFC or Split YFP)
5 Far-western analysis
最新课件
3
3 酵母双杂交技术 3.1 原理
Yeast cells that are mating. A zygote typically has three-lobed
shape, the lobes representing the two haploid(parental) cells and
the budding diploid cells.
Department of Plant Sciences, Tel Aviv University, Tel Aviv 69978, Israel
最新课件
44
Confocal images of bimolecular fluorescence complementation
(BiFC) studies
27
最新课件
28
4 pull down 1) 原理
最新课件
29
最新课件
30
2)试剂盒
最新课件
31
The MagneGST. Pull-Down System
最新课件
32
Figure 1. Overview of the MagneGST. Pull-Down System protocol.
11
Constructing AD fusion libraries by recombinationmediated cloning in yeast.
最新课件
12
cDNA library of oilseed rape line RS-1 constructed in
yeast
最新课件
13
Library screening by mating
最新课件
45
IPG735+PG736
最新课件
46
最新课件
IPG735+PG736 47
Ppn20-735+PG736
最新课件
48
Ppn20-735+PG736, 蛋白互作可能导致internalization
最新课件
49
多色荧光 互补技术
最新课件
50
蛋白质相互作用
研究方法
王心宇
College of Life Sciences
最新课件
1
1 研究蛋白质相互作用的意义
随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列
信息转向研究基因功能,一门新的学科———
蛋白质组学proteomics应运而生。蛋白质组
是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功
能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作
最新课件
14
Positive clones confirmed on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal
最新课件
15
检测特定两个蛋白是否互作
最新课件
16
pGADT7 Vector Information
最新课件
17
3.3 膜蛋白互作研究方法
－－－基于泛素的酵母双杂交 体系(mating-based Split ubiquitin system "mbSUS“)
DNA-binding and activating functions in a transcription
factor may comprise independent domains of the protein.
最新课件
4
The two hybrid technique tests the ability of two proteins to interact by incorporating them into hybrid proteins where one has a DNA-binding domain and the other has a transcriptionactivating domain.
最新er™ Library Construction & Screening Kits
最新课件
6
诱饵蛋白载体构建
最新课件
7
最课件
8
pGADT7-Rec Vector Informat最新课件
2) MbSUS 体系
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mbSUS 原理
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In vivo cloning into mbSUS vectors
GATEWAY cloning method
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P = Prey Protein, M = MagneG最S新T.课P件article.
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6 Far-western analysis
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7 双分子荧光互补技术 BiFC
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC) 分析技术，利用绿色荧光 蛋白(green fluorescent protein，GFP) 及其突变体 (YFP,CFP,BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割 成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋 白连接. 如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近， 就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近， 重新形成活性的荧光基团而发出荧光. 在荧光显微镜 下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用， 并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互 作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体 的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等， 这些信息对研究蛋白质相最互新课作件 用有一定意义。 38
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GFP及其各种突变体的片段互补特性
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Detection of protein–protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation
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GFP 的一些定点突变能明显地改变其波长性质. 产生 的突变体,具有产生多色光的特性，如：GFP66 位的 酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyan fluorescence protein，CFP)，203 位的苏氨酸突 变为酪氨酸后成黄色荧光蛋白(yellow fluorescence protein，YFP)，145 位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成 蓝色荧光蛋白(blue fluorescence protein， BFP) [3]. 2002 年Hu 等[1] 最先报道了用BiFC技术在活细 胞中观察bZIP 和Rel 家族蛋白的相互作用，利用的 就是YFP 作标记，在荧光显微镜下用525 nm 波长 直接检测黄色荧光.
Principle of the BiFC assay
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GFP的特性
绿色荧光蛋白(GFP) 来源于水母(Aequorea victoria)，分子质量约为27 kda，能在各种细胞中表 达. 受到激发时，不需要任何辅助因子，就能在活体 中发出绿色荧光. 1992 年，Prasher 等[2]克隆了GFP 基因. 随后，GFP 作为一种研究基因表达和蛋白质定 位的活体可遗传标记，在各种类型细胞的研究中得到 了广泛的应用.
用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每
个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,
构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,
对于蛋白质相互作用interactome的研究就
成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。
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2 蛋白质相互作用常用研究方法
1 酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)
2 pull-down
3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)
4 双分子荧光互补技术(Biomolecular fluorescence complementation,BiFC or Split YFP)
5 Far-western analysis
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3 酵母双杂交技术 3.1 原理
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shape, the lobes representing the two haploid(parental) cells and
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2)试剂盒
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The MagneGST. Pull-Down System
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Figure 1. Overview of the MagneGST. Pull-Down System protocol.
11
Constructing AD fusion libraries by recombinationmediated cloning in yeast.
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cDNA library of oilseed rape line RS-1 constructed in
yeast
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Library screening by mating
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IPG735+PG736
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IPG735+PG736 47
Ppn20-735+PG736
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Ppn20-735+PG736, 蛋白互作可能导致internalization
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多色荧光 互补技术
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蛋白质相互作用
研究方法
王心宇
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1 研究蛋白质相互作用的意义
随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列
信息转向研究基因功能,一门新的学科———
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是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功
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检测特定两个蛋白是否互作
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诱饵蛋白载体构建
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