免疫组化实验课件-20112
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是应用免疫学基本原理——抗原 抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原 理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来 确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对 其进行定位、定性及定量的研究，称为免 疫组织化学技术(immunohistochemistry) 或免疫细胞化学技术 (immunocytochemistry)
2. 冰冻切片免疫组化步骤
1. 阻断内源性过氧化物酶活性 2. 每个样品加1滴3%H2O2溶液（现用现配），室温下孵育10min.PBS冲 洗,3min×3次。 3. 2. .加封闭液： 4. 甩去PBS液，每张切片加1滴A液（山羊血清）,37℃下孵育10min（不用PBS洗） 5. 3. 加入一抗（保存液稀释） 6. 甩去封闭液，每个样品加50ul一抗（稀释度为1:100和一抗稀释保存液阴性对照）， 37℃孵育60min，PBS冲洗10min×3 7. 4. 加入二抗（即免疫组化试剂盒里的） 8. 甩去PBS液，每个样品加1滴B液（生物素化山羊抗兔二抗工作液），37℃下孵育 30min，PBS冲洗5min×3 9. 5 .加入C液（辣根酶标记链霉卵白素工作液）SABC 10. 甩去PBS液，每个样品加1滴C液（辣根酶标记链霉卵白素工作液），37℃下孵 育30min，PBS冲洗5min×3 11. 6.．DAB染色 12. 甩去PBS液，每个样品加1滴新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3-10min,阳性显 色为棕色或红色，阳性染色即DDW中止反应 13. 7. .苏木素复染 14. 滴2滴苏木素于组织切片上，染色时间为3-5分钟不等，用自来水冲洗 15. 8. 分化：1％盐酸酒精分化 20秒（<25s），自来水冲洗 16. 9. 返蓝：1％氨水返蓝，1min30s(>1min)， 自来水冲洗 17. 10.封片 18. 吹风机吹干，滴加一滴中性树脂，加盖玻片封片
二、免疫组化技术的优点
• 1、特异性强：抗原-抗体反应
• 2、敏感性高：卵白素-生物素-过氧化物酶复合 物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物 酶连结（SP）法 • 3、定位准确、形态与功能相结合
三、免疫组化染色注意事项
• （1）去除内源酶及内源性生物素 1) 去除内源酶 （免疫组化各种染色大部分是用过氧化物 酶来标记抗体的—— 3%过氧化氢水溶液 ）。 2) 去除内源性生物素 （内源性生物素易结合卵白素 ——0.01%卵白素溶液室温处理20min ）。 • （2）抑制非特异性背景着色 （常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可）。 • （3）抗原修复（多用于石蜡切片） （甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇）。
根据切片来源
• 组织标本-------免疫组织化学 石蜡切片 冰冻切片
• 细胞标本 -------免疫细胞化学
实验内容： 脾脏组织冰冻切片检测CD4的表达
五、实验材料和步骤
1.实验材料
（1）实验器械：镊子、湿盒、培养皿、广口瓶、盖玻片等 （2）组织切片：小鼠脾组织冰冻组织切片 （3）实验试剂： 1）一抗：Rabbit Anti-CD4（多抗） 2）免疫组化染色试剂盒 3% H2O2去离子水 （无色） A: 封闭用正常山羊血清工作液 （蓝色） B：生物素化山羊抗兔二抗工作液 （黄色） C：辣根酶标记链霉卵白素工作液（橙色）
3） DAB 显色试剂盒（20×）：（中杉金桥
）
试剂A: 浓缩缓冲液 (DAB Buffer，20×) 试剂B: 浓缩DAB溶液 (避光，20×) 试剂C: 浓缩过氧化氢溶液 (20×) 1ml DDW中A、B、C液各一滴（约50ul） DAB工作液 4）苏木素 5）1%盐酸酒精（分化用） 6）1%氨水（返蓝用） 7）中性树脂
四、免疫组化的分类
根据标记方式分类
• 免疫酶法 • 免疫荧光法 • 放射免疫自显影法
组织冰冻切片
• （一）优点： • 1．简便，快速，用时短。 • 3．抗原性保存较好。 • 4．能很好保存脂肪，类脂等成分。 • 5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类。
• （二）缺点： • 1．不容易做连续切片。 • 2．切取的组织不能过大。 • 3．不容易制作较薄的切片。 • 4．组织结构不如石蜡切片清晰。
2. 冰冻切片免疫组化步骤
1. 阻断内源性过氧化物酶活性 2. 每个样品加1滴3%H2O2溶液（现用现配），室温下孵育10min.PBS冲 洗,3min×3次。 3. 2. .加封闭液： 4. 甩去PBS液，每张切片加1滴A液（山羊血清）,37℃下孵育10min（不用PBS洗） 5. 3. 加入一抗（保存液稀释） 6. 甩去封闭液，每个样品加50ul一抗（稀释度为1:100和一抗稀释保存液阴性对照）， 37℃孵育60min，PBS冲洗10min×3 7. 4. 加入二抗（即免疫组化试剂盒里的） 8. 甩去PBS液，每个样品加1滴B液（生物素化山羊抗兔二抗工作液），37℃下孵育 30min，PBS冲洗5min×3 9. 5 .加入C液（辣根酶标记链霉卵白素工作液）SABC 10. 甩去PBS液，每个样品加1滴C液（辣根酶标记链霉卵白素工作液），37℃下孵 育30min，PBS冲洗5min×3 11. 6.．DAB染色 12. 甩去PBS液，每个样品加1滴新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3-10min,阳性显 色为棕色或红色，阳性染色即DDW中止反应 13. 7. .苏木素复染 14. 滴2滴苏木素于组织切片上，染色时间为3-5分钟不等，用自来水冲洗 15. 8. 分化：1％盐酸酒精分化 20秒（<25s），自来水冲洗 16. 9. 返蓝：1％氨水返蓝，1min30s(>1min)， 自来水冲洗 17. 10.封片 18. 吹风机吹干，滴加一滴中性树脂，加盖玻片封片
二、免疫组化技术的优点
• 1、特异性强：抗原-抗体反应
• 2、敏感性高：卵白素-生物素-过氧化物酶复合 物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物 酶连结（SP）法 • 3、定位准确、形态与功能相结合
三、免疫组化染色注意事项
• （1）去除内源酶及内源性生物素 1) 去除内源酶 （免疫组化各种染色大部分是用过氧化物 酶来标记抗体的—— 3%过氧化氢水溶液 ）。 2) 去除内源性生物素 （内源性生物素易结合卵白素 ——0.01%卵白素溶液室温处理20min ）。 • （2）抑制非特异性背景着色 （常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可）。 • （3）抗原修复（多用于石蜡切片） （甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇）。
根据切片来源
• 组织标本-------免疫组织化学 石蜡切片 冰冻切片
• 细胞标本 -------免疫细胞化学
实验内容： 脾脏组织冰冻切片检测CD4的表达
五、实验材料和步骤
1.实验材料
（1）实验器械：镊子、湿盒、培养皿、广口瓶、盖玻片等 （2）组织切片：小鼠脾组织冰冻组织切片 （3）实验试剂： 1）一抗：Rabbit Anti-CD4（多抗） 2）免疫组化染色试剂盒 3% H2O2去离子水 （无色） A: 封闭用正常山羊血清工作液 （蓝色） B：生物素化山羊抗兔二抗工作液 （黄色） C：辣根酶标记链霉卵白素工作液（橙色）
3） DAB 显色试剂盒（20×）：（中杉金桥
）
试剂A: 浓缩缓冲液 (DAB Buffer，20×) 试剂B: 浓缩DAB溶液 (避光，20×) 试剂C: 浓缩过氧化氢溶液 (20×) 1ml DDW中A、B、C液各一滴（约50ul） DAB工作液 4）苏木素 5）1%盐酸酒精（分化用） 6）1%氨水（返蓝用） 7）中性树脂
四、免疫组化的分类
根据标记方式分类
• 免疫酶法 • 免疫荧光法 • 放射免疫自显影法
组织冰冻切片
• （一）优点： • 1．简便，快速，用时短。 • 3．抗原性保存较好。 • 4．能很好保存脂肪，类脂等成分。 • 5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类。
• （二）缺点： • 1．不容易做连续切片。 • 2．切取的组织不能过大。 • 3．不容易制作较薄的切片。 • 4．组织结构不如石蜡切片清晰。