啮齿类小鼠γ-干扰素原核表达、纯化及功能鉴定

啮齿类小鼠γ－干扰素原核表达、纯化及功能鉴定目的：构建γ-干扰素的高效原核表达载体，进行γ-干扰素表达、纯化和鉴
定，并探索优化啮齿类γ-干扰素的制备工艺。

方法：用RT-PCR技术，从ConA 活化的小鼠脾细胞中扩增出mIFN-γcDNA，与原核表达载体pET30a(+)重组，表达和纯化重组蛋白His6-mIFN-γ，并用Western Blot检测该重组蛋白的生物学活性。

结果：构建了啮齿类γ-干扰素的高效原核表达载体，并实现了γ-干扰素的可溶性表达，且验证该γ-干扰素具有生物学活性。

结论：成功优化了生产干扰素的工艺，为国内外进行γ-干扰素研究奠定基础。

[Abstract] Objective:To clone murine interferon-gamma gene, do effective prokaryotic expression and purify recombinant murine IFN-γ for further study.Methods:To amplify mIFN-γcDNA from ConA-activated murine splenocytes by RT-PCR and clone into pET30a(+) vector．Then the target protein His6-mIFN-γ was induced by IPTG and purified with Ni2+-NTA agarose. The biologic activity was identified by western blotting.Results:The prokaryotic expression system of mIFN-γ was constructed．And the fusion protein mIFN-γ was dissoluble and bioactive.Conclusion:The technology of mIFN-γ production is successfully optimized. It lays a foundation of further research of IFN-γ．
[Key Words] IFN-γ；Prokaryotic expression；Purification
英國国立医学研究所的Isancs和Lindenman在研究病毒的干扰现象时发现了一种可溶性物质，进一步研究表明这一物质能够抑制多种病毒在细胞内的繁殖，于是将其命名为干扰素（interferons，IFN）[1]。

干扰素是一类由低分子可溶性蛋白组成的重要细胞因子，自1957年Isancs首次发现鸡干扰素以来，先后已有人、鼠、犬以及猪等动物的干扰素基因被成功克隆。

IFN-γ具有很强的抗病毒活性、免疫调节活性和抗肿瘤活性。

IFN-γ可通过多种途径来发挥抗肿瘤作用，既通过延长细胞周期以延缓肿瘤细胞的生长和繁殖；又可通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程；还可诱导肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)上调癌细胞对TNF受体、MHCⅡ类抗原等的表达，使其易被杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)识别而被杀伤[2]。

当病原体侵入机体组织后，淋巴细胞在感染部位聚集并释放干扰素等细胞因子。

IFN-γ主要通过JAK-STAT途径来发挥作用的。

IFN-γ与几乎分布于所有正常细胞表面的高亲合力的受体IFN-γR（IFNGR）结合并使受体发生二聚化后，受体的胞内近膜区可与胞浆内非受体TPK-JAK激酶(janus kinase)结合并发生磷酸化，进而与信号转导和转录激活因子1(signal transducers and activators of transcription，STAT-1)相结合。

在JAK催化下，STAT-1结合成活化的STAT-1二聚体转移入核，他们通过与IFN-γ活化位点(gamma-interferon activation sites，GAS) 结合而诱导免疫活性蛋白表达，如CD54、吲哚胺2，3－二加氧酶[3]（idoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）等。

据资料显示，我国在啮齿类γ-干扰素的克隆、制作方面还赶不上其他国家。

尽管国外已经制备有基因重组啮齿类γ-干扰素，但是由于其开发成本高、前期投入大，用于肿瘤药物的基础研究，价格相当昂贵，这也严重地限制了我国相关领域的基础研究。

因此本研究进行啮齿类γ-干扰素的制备对肿瘤药物的相关研究将具有重要的实际意义[4]。

1 材料与方法
1.1材料
5周C57BL/6雄鼠，由中山大学动物实验中心提供。

pET30a(+), 购自Novagen 公司。

大肠杆菌JM109和BL21由本实验室保存。

限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、AMV逆转录酶均购自TaKaRa 公司；IPTG购自华美生物工程公司；凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自Omega Bio-tek公司；镍离子螯合层析柱购自Pharmacia公司。

一抗兔抗IDO来自本实验室保存[5]；β-actin多克隆抗体购自杰特伟公司；羊抗兔HRP购自博士德生物有限公司；蛋白定量试剂为Bio-Rad 公司的Bio-Rad Protein Assay 试剂盒；RPMI 1640、DMEM培养基粉末购自Gibco公司；新生牛血清（NPS）购自PPA公司；小鼠mIFN-γ标准品购自晶美生物工程有限公司；其余试剂为国产分析纯。

1.2方法
1.2.1引物设计与合成根据NCBI Gene Bank发表的序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

其序列为，上游引物：5’-CAGAGCTTTCAGCAGCAGCTCCTTTTC-3’（含BamH Ⅰ位点）;下游引物:5’-TCGGATCCCACGGCACAGTCATTGAAAG-3’（含Hind Ⅲ位点）。

1.2.2目的基因的获取健康6周龄的雄性C57BL/6小鼠，无菌条件下取脾，放入盛有5 ml不含血清RPMI1640的培养皿中，不锈钢网（200目）磨碎过滤，使之成为单细胞悬液。

离心，弃上清，加入含有10 %新生牛血清RPMI1640，调整浓度为5×106个/ml，ConA(8 μg/ml)诱导24 h(37℃，5% CO2)。

用Trizol二步法进行RT-PCR扩增。

PCR反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环扩增30次,最后72℃延伸10 min。

扩增产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 pET30a(+)/mIFN-γ原核表达载体的构建与鉴定PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，凝胶回收试剂盒纯化回收。

质粒小提试剂盒小提质粒pET30a(+)；质粒pET30a(+)经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，凝胶回收试剂盒纯化回收。

T4 DNA连接酶连接纯化的PCR产物和pET30a(+)，将连接产物转化至感受态大肠杆菌JM109，卡那霉素抗性筛选，PCR及酶切鉴定阳性重组质粒pET30a(+)/mIFN-γ。

将pET30(+)/mIFN-γ转化至感受态大肠杆菌BL21，从转化平板上随机挑取单菌落，在3 ml LB中37℃震荡培养12~16 h，菌液-80℃冻存。

1.2.4 His6-mIFN-γ蛋白的融合表达取冻存菌接种于4~5 ml的LB（卡那霉素50 ng/ml），37℃培养过夜，按1∶50转接于LB（含卡那霉素50 ng/ml）中，37℃培养至OD值为0.6~0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG 37℃震荡培养3 h，并设IPTG未诱导对照组。

离心收集1.5 ml菌液，进行SDS-PAGE表达分析。

1.2.5 工程菌裂解后融合蛋白的可溶性鉴定取蛋白表达阳性的冻存菌种于4~5 ml的LB（卡那霉素50 ng/ml），37℃培养过夜，按1∶50转接于LB（含卡那霉素50 ng/ml）中，37℃培养至OD值为0.6~0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG 25℃震荡培养7 h，离心收集1.5 ml菌液，冰上适量溶菌酶裂解缓冲液裂解菌体，超声裂菌(输出频率为25 Hz，4℃，30 s×10)。

4℃,15 000 r/min离心15 min，分别取适量上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的分布，其余冻存于-80℃冰箱。

1.2.6 融合蛋白His6-mIFN-γ的纯化架好镍离子亲和层析柱，先以Washing buffer流洗(流速为2 ml/min)达平衡后，换成Native Binding buffer使其管柱结合上新的镍离子。

再以Washing buffer流洗达平衡后，注入保存的蛋白上清液，以Binding buffer流洗（流速为1 ml/min）约250 ml。

再以Washing buffer流洗(流速为2 ml/min)约300 ml。

最后以Elution buffer洗脱，连续收集洗脱液，每次收集14 ml。

分别取少量Binding buffer洗脱液，末次Washing buffer洗脱液及Elution buffer洗脱液进行SDS-PAGE分析。

1.2.7 纯化蛋白的超滤将收集到的Elution buffer洗脱液放入截流孔径5 KD 的超滤管中，超滤20 min，2 800 g/min，4℃。

用PBS和5％的甘油清洗，继续超滤20 min，2 800 g/min。

收集超滤后的蛋白，分装于1.5 mlEP管中，冻存于-80℃冰箱中。

1.2.8 Western Blotting鉴定融合蛋白His6-mIFN-γ的生物学活性以小鼠巨噬细胞RAW264.7作为待测样本，检测IFN-γ诱导前后细胞内IDO表达的情况。

取标准小鼠IFN-γ作为阳性对照，均诱导24 h。

光学显微镜下观察其形态学变化。

Western Blotting参照《分子克隆》方法进行。

电压80~100 V进行10%SDS-PAGE 电泳，电转100 V，70 min。

2 结果
2.1 目的基因的获取
应用设计的特异性引物，采用RT-PCR扩增mIFN-γ，1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，可见426 bp左右有一条特异条带，与预期片段大小相符；见图1。

2.2 pET30a(+) /mIFN-γ原核表达载体的鉴定
克隆至pET30a(+)载体的重组质粒以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，分别切出426 bp 和5 422 bp左右2个片段，见图2。

与预想结果一致，证明构建重组
质粒成功。

His6-mIFN-γ的表达和纯化pET30a(+)/mIFN-γ转化至感受态大肠杆菌BL21，随机挑选单克隆菌落，扩大培养经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析，可看到目的蛋白在2、5和6号菌落中得到融合表达。

经诱导表达的目的蛋白的Mr约18 kDa，与其理论值基本接近，表明pET30a(+)/mIFN-γ可以在大肠杆菌中BL21融合表达，见图3。

超声裂解菌后分别取适量上清和沉淀做SDS-PAGE，发现目的蛋白多集中在上清液，大部分是以可溶形式表达，见图4。

阳性菌株经扩大培养及IPTG诱导表达，用镍离子亲和层析柱纯化收集到的可溶性蛋白，SDS-PAGE分析，可看到2~9号收集液在18 kDa左右均有一条清晰的条带，并且5~9号收集液中几乎没有杂带。

可见利用镍离子亲和层析柱对His6-mIFN-γ蛋白液的纯化效果极好，见图5。

2.3 His6-mIFN-γ生物活性鉴定
分别将纯化的重组蛋白His6-mIFN-γ和标准品mIFN-γ刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7，24 h后可见受刺激的细胞发生明显的形态学变化，见图6。

Western Blotting分析可见经His6-mIFN-γ和标准品mIFN-γ诱导后，RAW264.7表达IDO 的活性明显升高，见图7。

图1PCR产物电泳图
M：DNA 标准DL 2000;1：PCR产物
Fig.1 Electrophoresis map for PCR products
M：DNA Marker DL 2000;1：PCR amplification
图2重组质粒的酶切电泳图
1：PCR 扩增产物mIFN-γ片段;2：经双酶切的重组质粒;
3：未经处理的重组质粒;M：DNA 标准DL 2000
Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid
1：PCR amplification mIFN-γ;2：BamH Ⅰ+ Hind ⅢpET30/mIFN-γ;
3：pET30/mIFN-γ;M, DNA Marker DL 2000
图3IPTG诱导蛋白的SDS-PAGE
M：中分子量蛋白marker；1：未加IPTG誘导菌液总蛋白；
2~6：IPTG诱导菌液总蛋白
Fig.3SDS-PAGE of induced products with IPTG
M：protein molecular weight marker; 1：Uninduced pET30a(+)/mIFN-γ；
2~6：induced pET30a(+)/mIFN-γ
图4超声裂解菌SDS-PAGE电泳
M：中分子量蛋白marker；1：裂解菌后的上清液；2：裂解菌后的沉淀物Fig.4 SDS-PAGE of split products
M：Protein molecular weight marker；1：Superior liquid of split products；
2：Deposit of split products
图5纯化啮齿类γ-干扰素的SDS-PAGE图
M：中分子量蛋白marker；1：Binding buffer洗脱液；2：末次Washing buffer 洗脱液，3~9：Elution buffer洗脱液
Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant murine IFN-γ（m IFN-γ）
M：moderate protein molecular weight markers；1：Binding buffer eluent；
2：ultimate Washing buffer eluent 3-9，Elution buffer eluent
图6mIFN-γ刺激RAW264.7 后的形态学变化
1：未加mIFN-γ刺激的RAW264.7细胞形态；2：标准品mIFN-γ刺激后的RAW264.7细胞形态；3：His6-mIFN-γ刺激后的RAW264.7细胞形态Fig.6 microscope observation of RAW264.7 induced by mIFN-γ
1：morphology of RAW264.7 without IFN-γ；2：morphology of RAW264.7 induced by mIFN-γ standard；3：morphology of RAW264.7 with His6-mIFN-γ图7IDO在RAW264.7细胞中的表达情况
1：His6 -mIFN-γ刺激后RAW264.7细胞溶胞产物；2：标准品mIFN-γ刺激后RAW264.7细胞溶胞产物；3：未加工mIFN-γ刺激的RAW264.7溶胞产物
Fig.7 Western Blotting analysis of indoleamine 2,3-dioxygenase induced by mIFN-γ in RAW264.7.
1:cell lysate of RAW264.7 induced by His6-mIFN-γ; 2:cell lysate of RAW264.7 induced by mIFN-γ standard；3:cell lysate of RAW264.7 without IFN-γ
3 讨论
干扰素是一类具有高活性、多功能的细胞因子，具有广泛抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物学功能。

其广阔的应用前景，使世界各国竞相开展基因工程干扰素的研究，促进其产业化[4]。

本实验利用RT-PCR技术，扩增小鼠γ-干扰素基因，定向克隆至pET30a(+)，成功构建了高效的原核表达载体。

本实验优化了诱导大肠杆菌表达融合蛋白的温度为25℃，经SDS-PAGE证实了在此温度下，我们所构建的大肠杆菌表达系统能夠表达可溶性的干扰素，这样就避免了原核表达外源蛋白以难溶性的包涵体形式表达的缺点，减少了包涵体的变性以及复性的过程，这样将大大简化工业生产干扰素的程序。

优于文献所报道的以包涵体形式原核表达干扰素的方法[6~8]。

而且本方法可利用大肠杆菌容易培养且费用低、对许多外源蛋白有很强的耐受能力以及能高水平地表达外源蛋白等优点，大大降低了工业生产干扰素的成本。

同时，本实验选用镍离子亲和层析柱一步纯化法纯化了6×His标签的mIFN-γ。

经凝胶灰度分析软件分析目的蛋白的纯度达到90%以上。

该层析柱成分简单，纯化产物易于检测，产品质量易于控制。

[参考文献]
[1]Isancs A, Lindenmann J. Virus interference:I. The interferon[J].Proc R Soc Lond B Biol Sci, 1957, 147（927）:258-267.
[2]Anthony Meager. Biological assays for interferons[J]. Journal of Immunological Methods, 2002, 261: 21-36.
[3]Chon SY, Hassanain HH, Gupta SL. Cooperative involvement of interferon regulatory factor 1 and p91 (Stat1) response elements in interferon-γ inducible expression of human indoleamine 2,3–dioxygenase gene[J]. J Biol Chem, 1996, 271: 17247-17252.
[4]刘皓，焦丹，葛继乾.干扰素制品国内市场的现状与发展分析[J]. 中国药业, 2001, 10（10）: 10-13.
[5]谢白露，刘鹏，杜军,等. 人吲哚胺2,3-双加氧酶多克隆抗体的制备[J]. 癌症, 2007, 26(3): 329-332.
[6]李蕙，高荣，武梅，等. 藏猪γ-干扰素基因cDNA的克隆及序列分析[J]. 中国兽医科技, 2003, 33(5): 48-51.
[7]万建青，吴文学，夏春. 毕赤酵母表达猪干扰素-γ基因及其抑制蓝耳病病毒效果[J].生物工程学报, 2002, 18(6): 683-686.
[8]吴文学，夏春，汪明，等.猪干扰素γcDNA的分子克隆与在大肠杆菌中的表达[J].农业生物技术学报，2002，10（3）：255-258.
“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”。