酶与酶工程绪论

微生物是地球上重要的可再ห้องสมุดไป่ตู้资源，有着重要的应用价值。
1.1 关于酶Enzyme
酶是由活细胞产生的具有催化功能的生物分子 /蛋白质。
研究酶的结构与功能、酶的性质及作用机理对 于阐明生命现象的本质具有十分重要的意义。
从酶的水平去探讨生命活动的关系，探讨酶与 代谢调节、疾病、生长发育等的关系，具有重 要的科学意义和实践意义。
天然酶在工业上应用受到限制的主要 原因有：
①大多数酶脱离其生理环境后极不稳定， 而酶在生产和应用过程中的条件往往与 其生理环境相去甚远；
②酶的分离纯化工艺复杂；
③酶制剂成本较高。
根据研究和解决上述问题的手段不同把酶 工程分为化学酶工程和生物酶工程。
化学酶工程：天然酶、化学修饰酶、固定 化酶及化学人工酶的研究和应用；
水 相 ）
非蛋白酶
印记酶(imprinting enzyme)
核酶(ribozyme, RNAzyme)
脱氧核酶(detoxribozyme, DNAzyme)
1.4 酶与酶工程的研究趋势
从发展方向分析，今后十年酶与酶工程 领域的研究热门有以下几方面：
酶结构与功能的研究 生物催化过程的研究 改造酶的催化特性及新酶设计 应用酶工程
蛋白质工程 生物催化过程的开发流程
生物催化过程又是典型的高度不均一过 程，理论上
需要特殊设计的硬件部分， 需要有高催化效率的生物催化剂， 需要实施计算机控制的软件， 需要能降低成本的回收和再利用技术，
这是生物催化过程，尤其是工业生物催 化的四个“必需”。
3、改造酶的催化特性及新酶设计
③极端环境条件下新酶的研究。
已发现的极端微生物：
能够在250~350C条件下生长的嗜热微生物， 能够在-10~0C条件下生长的嗜冷微生物， 能够在pH2.5条件下生长的嗜酸微生物， 能够在pH11条件下生长的嗜碱微生物， 能够在101.325MPa下生长的嗜压微生物， 以及在高温（105C）和高压（40.53MPa）
1、酶的结构与功能的研究：
研究酶的结构与功能、酶的催化作用机理永 远是酶学研究的主题。
酶的结构尤其是动态结构、功能尤其是空间 结构与功能的关系共同构筑了分子酶学的主 要内容，功能酶学和蛋白质组学的渗入和参 与为酶学研究增加了新内涵。
2、生物催化过程的研究：
通常生物催化过程不受通用的技术或底物和产 物性质的限制。新的催化过程的可行性往往由 生物催化剂效率决定。
反之，定向进化也可以与定位突变结合起来， 用定位限制随机以减少筛选的库容；用随机 扩大定位以增加突变位点。此方法是通过控 制合成的底物和浓度比例来实现碱基对的错 配。
构建新酶是酶工程研究的前沿和热点，如 根据过渡态理论采用诱导法、拷贝法、插 入法、化学修饰法和基因工程法制备抗体 酶。
随着催化作用机理及化学合成技术的发展， 使用分子印迹和生物印迹技术制备的人工 合成酶将会在诸如氧化还原反应、有机相 酶反应及特殊催化反应中大显身手。
分子酶学工程包括在分子水平认识酶的基础 上改进、模拟酶和全新设计酶。
分子酶学工程的内涵是以天然酶的结构与功 能为基础，以酶分子工程为核心，研究工程 酶的理论、策略和方法，研究工程酶的催化 效率和机制，开发酶的新功能、新性质，发 现和创造经济实用的新型生物催化剂。
分子酶学工程的概念
分子酶学工程可以看做是蛋白质工程 （包括分子进化）和酶工程相融合所产 生的一门科学技术。
生物催化过程不同于常规的化学过程，它经常 受到在技术条件下的蛋白质稳定性及在细胞中 生理生化作用的影响。
底物
过程
产物回收
下游
经济情况 原位回收
产物
酶或细胞 筛选
生物催化剂选择
应用
稳定性 固定化 辅因子再生 多相系统
新反应
生物催化剂表征
生物催化剂工程
动力学
细胞工程 过程工程 酶工程
反应条件 结构信息
核酶可催化四种反应。除RNA有催化活性 外，近年来发现DNA也有酶活性，此外还 发现RNA具有催化自身复制的功能。
RNA具有信使编码功能与催化功能，实现 遗传信息的复制、转录和翻译，是生命进 化中最简单、最经济的与催化自身复制加 工的RNA世界的原始方式，这种高度序列 特异的核酶很大的应用价值。
•在了解催化机制的基础上人为地提 高酶的催化效率是分子酶学工程的主 要目标，
•并由此创造出高催化效率、经济实 用的酶。
分子酶学工程的出现表明人们已经按照 自己的意图来改进、模拟和设计新酶并 且正在有效地把工程酶应用于经济建设 和科学技术研究中去。
分子酶学工程的基本策略和方法
分子酶学工程研究主要涉及三个相互关系的 内容：
它采用随机过程，用易错PCR（Errorprone PCR）产生基因突变从而进行筛选。 体外重组或DNA改组（DNA Shuffling）促 进了定向进化的发展。
这些方法迅速地组合了有益突变并拓展了 顺序的多样性。
获得L-天冬氨酸进化酶的活力比天然酶高 28倍；
天冬氨酰酶二肽酶进化酶的活力比天然酶 提高47倍；
酶是一类特殊的催化剂
酶是高效催化剂。
典型的表观二级速率常数(kcat/Km)为 106~108L/(mols)
能在温和条件下有效地催化很难、甚至不可能的化 学转化(kcat/kuncat)可达1017。
酶是有高度选择性的催化剂。
酶对映体的选择性日益强劲地用于手性药物生产。 酶促反应副产物少、条件温和。
分子酶学工程包括在分子水平认识酶的 基础上改进酶、模拟酶和全新设计酶。
改进，模拟，设计
结构分析
工程 酶
功能分析
纯化
天然酶
分子酶学工程基本流程图
分子酶学工程的概念
分子酶学工程的内涵:是以天然酶的结构 与功能为基础，以酶分子工程为核心，研 究工程酶的理论、策略和方法，工程酶的 催化效率和机制，开发酶的新功能、新性 质，发现和创造经济实用的新型生物催化 剂。
酶是具有生物催化功能的生物大分 子。
1982年Cech小组发现RNA本身可以是一 个生物催化剂，称之为核酶Ribozyme。
事先设计好的过渡态类似物为半抗原，按 一般单克隆抗体制备程序获得具有催化活 性的抗体。称之为抗体酶Abzyme。
酶有两大类别：
主要由蛋白质组成称为蛋白类 酶（P酶）；
改造酶的特性最有效的方法是定位突变 （Site-directed Mutagenesis）和定向进 化（Directed Evolution in Vitro）。
定位突变技术只对某些氨基酸残基进行 替换、删除、天加或修饰，并不能从根 本上改变酶的高级结构，故有一定的局 限性。
体外定向进化不需要酶的结构、功能关系 和催化机制方面的信息。
分子酶学工程的基本策略和方法
4）核酶和脱氧核酶也成为分子酶学工程的一 个新领域，别构酶和脱氧酶的设计和应用将可 能成为纳米技术中的重要内容；
5）生物传感器是分子酶学工程不可分割的组 成部分， 它正向生物芯片、生物计算机方向 发展；
分子酶学工程的基本策略和方法
6）组合生物催化（combinatorial biocatalysis）可以高效率产生新型化合物 库，为酶的抑制剂和酶标药物的设计开辟 一条新途径。
主要由RNA或DNA组成，称为 核酸酶（R酶）。
1.2 关于酶工程Enzyme Engineering
酶工程是生物工程的主要内容之一。
是随着酶学研究的迅速发展特别是酶的应用 推广使酶学和工程学相互渗透，结合而发展 成的一门新的科学技术，是酶学、微生物学 的基本原理与化学工程有机结合而产生的交 叉学科。
对海藻糖-6-磷酸合成酶的操纵子的定向进 化，建立Shuffling-PCR方法，使海藻糖的 产量提高12.3倍。
定位突变和定向进化两种方法各有优缺点， 如果将两者组合，会出现优势互补。
试验已经证实，定向进化方法可以有效地扩 大定位突变，定位突变可以把关键氨基酸或 结构片段引入酶分子中，这是定向进化办不 到的。
酶具有高度的底物识别能力和产物的定向能力
酶的催化反应由于极大地简化了化学反应 的条件，因而使化学试剂的应用和副产物 大量减少，从而在很大程度上减少了对环 境的污染。
由于日益增加的环境和经济压力，生物催 化剂得到了迅速发展。
微生物为酶提供了丰富的、可再生的 资源
基因工程技术进一步解决了稀有酶的 来源问题
2）在分子免疫学、有机化学和分子酶学 基础上，应用细胞工程、抗体工程及分子 印记等技术从理论和实际两方面研究抗体 酶、合成酶、印记酶和酶的化学修饰；
分子酶学工程的基本策略和方法
3）非水相分子酶学工程的研究打破了酶只能 在水相中催化的传统概念，不仅开辟了分子酶 学工程的新领域，而且为酶在化学、材料科学、 医药科学及生物检测中的应用展示了广阔的前 景，同时也可能成为发展和实现“绿色化学” 的一个关键的突破点；
条件下生长的嗜热嗜压微生物等。
为新酶种和酶的新功能的开发提供了广阔的空 间。
➢ 基因组学与蛋白质组学的进展将会推动和 帮助新酶的发现。
工程酶的分类
化学修饰酶
蛋白质工程酶
工 程 酶 （
蛋白质酶 进化酶(evolved enzyme) 模块酶(modular enzyme) 杂合酶(hybrid enzyme)
水
肽酶(pepzyme)
相 ，
模拟酶 抗体酶(abzyme)
非
合成酶(synzyme)
❖ 一是发展构建工程酶的理论、策略和方法； ❖ 二是在考察和研究生物多样性的基础上发现
新的酶及其工程化； ❖ 三是扩大工程酶的应用领域。
分子酶学工程的基本策略和方法
1）在对酶结构与功能分析的基础上，应 用基因工程、蛋白质工程（包括分子进化） 技术改变或完善天然酶某些性质并构建出 更加实用的新酶，如进化酶、模块酶和杂 和酶等；
95oC-52oC-72oC
Human insulin produced by engineered bacteria.
天然酶往往不完全具备应用所要求的所 有特性（如操作稳定性、非水相催化、 更高的立体选择性和专一性、对非天然 底物的催化活性等）
分子酶工程为天然酶的改造提供了可行 性
Antibiotic resistant marker
4、 应用酶工程
研究重点放在：
①开辟酶或微生物法转化合成有用化合物的新 途径。在有机合成中重点解决不对称合成和拆 分醇、醛、酮、酸、胺、氨基酸、抗生素等手 性化合物及药物。
②非水相介质中酶促催化是新热点。非水相介 质中酶催化已应用于许多有用的药物，生物大 分子、手性化合物、化工中间体及非天然产物 等有机合成，突破了酶水相催化的传统概念， 具有巨大的应用前景。
生物酶工程则是以酶学和以基因重组 技术为主的现代分子生物学技术相结 合的产物，
主要包括：
①用基因工程技术大量生产酶（克隆 酶）；
②修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变 酶）；
③设计新的酶基因，合成自然界不曾有 的新酶。
1.3 分子酶学工程（Molecular Engineering）
是酶工程在分子水平上的体现。
课程介绍
教材：
《酶与酶工程》袁勤生、赵健主编，华东理工大学 出版社
主要参考教材：
《分子酶学工程导论》张今、曹淑桂、罗贵民等主 编，科学出版社
《现代酶工程》梅乐和、岑沛霖主编，化学工业出 版社
《生物催化—基础与应用》，Andreas S.Bommarius, Bettina R. riebel,孙志浩、许建和译， 化学工业出 版社
它是从应用的目的出发研究酶在一定生物反 应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转 化成有用物质的技术，是生物工程的重要组 成部分。
酶是生物体内进行自我复制新陈代谢所 不可缺少的生物催化剂。
由于酶能在常温、常压、中性pH等温和 条件下高度专一有效地催化底物发生反 应，所以酶的开发和利用是当代生物技 术革命中的重要课题。
目前已鉴定的酶有3000多种。
Temperature classes
Industrial application of thermophily
Industrial enzymes
Higher speed Lower cost
Taq DNA polymerase and PCR
DNA amplification Repetitive melting and annealing （退火）