免疫细胞的分离及检测技术课件

Ficoll分离液---聚蔗糖-泛影葡胺溶液
➢2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1 份34%泛影葡胺生理盐水溶液， 比重为1.077± 0.002
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
二 、淋巴细胞分离
（去单核细胞）
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ 磁铁吸引法 ➢ Percoll 分离液法
二、B细胞表面标志
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活 细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死 亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细 胞而使细胞着色（蓝色）。
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。
➢ 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分 子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细 胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B 细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标， 以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1 和B2两个亚群；目前多以CD3-、 CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标 志。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定，临床上将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为 NK细胞。
T细胞及NK细胞
第三节 其他的免疫细胞
抗原提呈类细胞表面标志
第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用
➢ 免疫细胞表面标志的检测方法 ➢ 淋巴细胞表面标志检测的临床意义
一、胞化学法 ➢免疫荧光法 ➢流式细胞分析法
二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义
➢ 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功 能的重要指标。
➢ 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助 于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和 移植排斥反应的监测。
临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化
可直接上流式细胞仪检测， 不影响散射光。 需要很强的磁场来分离细胞。
得率不高。
纯度低。
纯度高。
分离速度快。
分离速度慢。
成本低。
需要很强的磁场来分离细胞， 需要一次性的分离柱，不能 在普通试管进行。
免疫磁珠法细胞分选过程
免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置
全自动细胞分选系统
流式细胞分析仪
尼龙毛柱分离法
• 方法：淋巴细胞→通过聚酰 胺纤维管→洗脱下来的是T 细胞
四、T细胞亚群的分离
➢亲和板结合分离法 ➢磁性微球分离法 ➢荧光激活细胞分离仪分离法
亲和板结合分离法
• 方法：将所需的细胞对应的 单克隆抗体包被于小管内→ 加入淋巴细胞→形成Ag-Ab 复合物→洗去不反应的物质。
磁珠大小可以选择
免疫细胞
➢ 所有与免疫相关的细胞都属于免疫细 胞.
➢ 淋巴细胞 ➢ 抗原提呈细胞(APC) ➢ 其他
第一节 免疫细胞的分离
➢外周血单个核细胞分离 ➢淋巴细胞的分离 ➢T细胞和B细胞的分离 ➢T细胞亚群的分离
一、外周血单个核细胞分离
➢ 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单
分离细胞的保存及活力测定
• 分离细胞的保存：两种方式 • 细胞活力测定：台盼蓝染色
分离细胞的保存
1、短期保存 用含有10%~20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、
RPMI 1640培养液可保存数周。 2、长期保存及复苏 保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196℃)中保存。
其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速 离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血 清配制成适当浓度的细胞悬 液，分装于冻存管内， 立即放入降温过渡站( -80℃)中，继而进行降温(196℃)冷冻。 复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 ℃温水中，融 化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护 剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。
核细胞（monocyte）。 ➢ Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
细胞分离基本原理
➢不同细胞密度不同 ➢不同细胞表面生物学特性不同 ➢不同细胞表面分化抗原不同
不同细胞密度不同
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
细胞表面分化抗原（CD抗原）
➢适用于T、B细胞的分离 ➢已知CD抗原细胞亚群的分离 ➢未知CD抗原细胞亚群的分离 ➢（阴性分选）
一、T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th） ➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） ➢ CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）
大小免疫磁珠分离细胞的特点比较
比较项目 对细胞的影响
对流式细胞仪的影响 分离条件要求 收率 纯度 分离时间 分离成本
大磁珠
小磁珠
对细胞造成机械压力，影响 其生物学活性，不利于分离 后培养。
阻塞流式细胞仪的喷嘴，影 响散射光。
技术简单，分离可在试管中 完成。
得率高。
对细胞温和，不影响分离细 胞的后续培养。
（连续密度梯度离心）
贴壁粘附法
➢原理：利用单核细胞具有贴 壁生长的特点
吸附柱过滤法
原理：利用单核细胞具有贴壁 生长的特点
磁铁吸引法
原理：利用单核细胞具有吞 噬 功能的特点
三、T细胞和B细胞的分离
➢E花环沉降法 ➢尼龙毛柱分离法
E花环沉降法
➢ 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→ 加入分层液→T细胞形成E花环 而沉于管底→悬液中为B细胞。
小结
➢ 淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在 光学显微镜下的形态基本是一样的，因此 要对其进行进一步的分类和观察就不能采 用形态学的方法，而要依靠对其表面标志 的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞 的表面标志是CD抗原。
➢进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋 巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前 看来，还很少有只通过一个CD抗原就能 将某一类淋巴细胞亚群指示出来的CD抗 原，CD抗原指示出来的淋巴细胞亚群多 数都是相对特异。