肝癌、结肠癌干细胞样细胞新型培养体系及其细胞系建立的研究

本论文采用不同肿瘤干细胞培养体系逐步筛选适合肝癌结肠癌干细胞样细胞培养的 新型培养体系，将各种肿瘤干细胞培养液编为Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３。实验结 果表明Ｂ１为适合结肠癌干细胞样细胞培养的新型培养体系，而Ｂｌ，ＣＩ，Ｃ３为适合肝癌干细 胞样细胞培养的新型培养体系。肿瘤干细胞培养液Ａ１、Ａ２培养细胞时，Ａ１干细胞培养液 培养的细胞不会形成悬浮细胞球体，Ａ２干细胞培养液培养的细胞零散聚集或是细胞球体不 能连续传代；Ｂｌ、Ｂ２干细胞培养液中，Ｂ１肿瘤干细胞培养液培养的人肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ 细胞和人结肠癌细胞系ＳＷ６２０细胞具有球状体出现，与文献［２１，２２］＠所报道的ＣＳＣ形态类 似，检测的ＣＳＣ标记基因均有高表达。人结肠癌细胞系ＳＷ６２０细胞来源的悬浮细胞球能 够连续传代下去，可连续培养两个月，保存建系。人肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ细胞来源的悬浮细 胞球能够连续传代一个月。利用Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３肿瘤干细胞培养体系培养人肝癌细胞系Ｈｅｐ３Ｂ 细胞和Ｈｕｈ７细胞，用Ｃ１、Ｃ３培养两天后传代，传代后第二天发现细胞悬浮，并聚集成 球状体细胞较透亮，再次传代后仍有细胞聚集，与受精卵发育到四细胞期、八细胞期似的 聚集，部分细胞死亡部分细胞生长，悬浮细胞球体能够连续传代下去，并检测ＣＳＣ标记基 因均有高表达，保存建系。
ｐａｓｓａｇｅ．Ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ Ｂ １ ａｎｄ Ｂ２，ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈｅｐ３Ｂ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＷ６２０ ｂｏｔｈ ｈａｄ ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ ｏｎｌｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓｐｈｅｒｅ ｆｏｒ ２ ｍｏｎｔｈｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＳＷ６２０，ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈｅｐ３Ｂ ｃｏｕｌｄ ｓｅｒｉａｌｌｙ ｐａｓｓａｇｅ ｆｏｒ ｏｎｅ ｍｏｎｔｈ．Ｔｈｕｓ ｗｅ ｕｓｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ Ｃ １，Ｃ２ ａｎｄ Ｃ３ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｈｅｐ３Ｂ ａｎｄ Ｈｕｈ７．Ｗｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｏｓｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ，ｃｏｕｌｄ ｇｒｏｗ ｉｎｔｏ ｓｐｈｅｒｅ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｍａｎｙ ｃｅｌｌｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｅｄ，ｔｈｏｓｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｕｌｄ ｆｏｒｍ ｓｐｈｅｒｅ ａｇａｉｎ ａｆｔｅｒ ｐａｓｓａｇｅ． Ｗｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｋｅｒ ｇｅｎｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．
ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ Ａ１ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｆｏｒｍ ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ，ｂｕｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ Ａ２ ｍａｄｅ ｃｅｌｌｓ ｌｏｏｓｅｌｙ ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｏｒ ｆｏｒｍ ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ
ｒｅｃｒｕｄｅｓｃｅｎｃｅ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔ ｗｅ ｈａｖｅ ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｔａｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｅｏｐｌｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｍａｋｅｒ ｇｅｎｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ
浙江理工大学 硕士学位论文 肝癌、结肠癌干细胞样细胞新型培养体系及其细胞系建立的研
究 姓名：赵清霞 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：钱其军
20100301
浙江理工人学硕士学位
肝癌、结肠癌干细胞样细胞新型培养体系及其细胞系建立的研究
摘要
干细胞是一类具有自我更新和增殖分化潜能的原始细胞，这种细胞能分化为特定组织 中一个或者多个具有特定功能的终末细胞。成体干细胞的主要生物学特征是自我更新和增 殖分化形成新生成熟组织，与恶性肿瘤细胞的生长繁殖、转移扩散以及放化疗后的再生复 发十分相似。根据干细胞的这种生物学特性和恶性肿瘤在临床上的生物学表现，近年来提 出在肿瘤的瘤体内也存在与干细胞具有相似生物学活性的一类细胞群体，科学家命名这种 存在于肿瘤细胞群体中的特殊细胞为肿瘤干细胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ），或称之为肿瘤起始细胞 （ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ，Ｔ．Ｉｃ）。最近几年报道的大量的资料表明，大多数肿瘤细胞群中存在肿 瘤干细胞，它在肿瘤发生、发展、转移和复发中起关键作用。它可能从根本上改变人们对 肿瘤的认识，是肿瘤治疗新靶标的希望所在【ｌ】，因此人们对其生物学特性及其特异标记基 因深入研究。本课题就是采用不同的培养体系在肿瘤细胞中分选培养肿瘤干细胞样细胞， 检测肿瘤干细胞标记基因的表达情况。
ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．Ｔｈｉｓ ｐｒｏｊｅｃｔ ｕｓｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍｓ ｔｏ ｓｏｒｔ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ
ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂ １，Ｃ １，Ｃ３ ａｒｅ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｎｏｖｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ
ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｃｅｌｌｓ．
Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍｓ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｓｃｒｅｅｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｅｎｒｉｃｈ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｗｅ ｎａｍｅｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍｓ Ａ ｌ，Ａ２， Ｂ １，Ｂ２，Ｃ １，Ｃ２，ａｎｄ Ｃ３．Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ Ｂ Ｉ ｉｓ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｎｏｖｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ，ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｅ，ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ
ＩＶΒιβλιοθήκη 浙江理工大学硕士学位论文缩略词表
缩写
ｂＦＧＦ ＢＳＡ ＣＳＣ ＤＭＥＭ ＤＭＳＯ ＥＧＦ ＥＳＣ ＦＡＣＳ ＦＢＳ ＦＧＦ．１０ ＨＣＣ ＩＧＦ．１ ＭＡＣＳ ＮＥＡＡ ＰＢＳ
ＩＩＩ
浙江理工大学硕士学位 ｍｅｄｉｕｍ Ｂ２．Ｔｈｏｓｅ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｋｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｉｇｈｌｙ．Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｒｉａｌ ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌ
英文全称
ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
浙江理Ｔ大学硕十学位
本课题的研究表明我们建立了几种适合肝癌结肠癌肿瘤干细胞样细胞培养的肿瘤干 细胞培养体系。并且能够从肿瘤细胞系中分选并培养得到肿瘤干细胞样的细胞，其形态及 标记基因的表达均与文献上所报道的肿瘤干细胞相似，并建系，为肿瘤干细胞研究的后续 实验奠定基础。
关键词：肿瘤干细胞干细胞培养基悬浮细胞球体标记基因
Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｒｅｅ ｎｏｖｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ．．１ｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｏｒｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ－－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ
ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ｍｅｔａｂａｓｉｓ，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｄｅｓｃｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ／ｏｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ
ｍａｌｉｇｎａｎｔ．Ｉｎ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ，ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｓｏｍｅ ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ ｐｒｏｐｏｓｅ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ａ ｇｒｏｕｐ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｔｅｍ’Ｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ，ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｃａｌｌｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｏｒ ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ，Ｔ－ｌｃ． Ｒｅｃｅｎｔｌｙ，ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｄａｔａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｍｏｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｌａｙ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｍｅｔａｂａｓｉｓ，
ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ．Ｂｏｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｍａｋｅｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｏｓｅ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｒｄｓ．Ｗｅ ｃｏｕｌｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ—ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ｓｅｔｔｌｉｎｇ
10浙江理工大学硕士学位论文第二章人肝癌干细胞样细胞的新型培养基的筛选及肿瘤细胞系的建立21实验器材211实验材料人肝癌细胞株hep3b人肝癌细胞株huh7212实验试剂与药品n2b27试剂名称dmemf12fbsneurobasavmamediumbsaegffgf10igf1bfgfheparin公司gibcogibcosigmasigmagibcosigmagibcordrdinvitrogengibcoatccatcc浙江理工大学硕士学位论文非必须氨基酸胰蛋白酶dmem高糖二甲基亚砜edtaglutamaxtilli碳酸氢钠trypsininhibitor庆大霉素p巯基乙醇gibcogibcogibcosigmagibcogibc0gibc0gibco上海中西制药invitrogenquantscriptrtkitquantcdna第tiangen一链合成试剂盒sybrgreenrealtimepcrmastertoyobomixplus试剂盒无水乙醇上海振兴化工一厂氯仿异丙醇depc213主要仪器设备仪器名称xdsib倒置相差显微镜中国医药集团上海化学试剂公司国药集团化学试剂有限公司12sigma公司重庆光电仪器有限公司浙江理工大学硕士学位论文c02培养箱离心机超净工作台超低温冰箱液氮罐程序降温盒恒温水浴箱倒置相差显微镜细胞培养瓶血球计数器法国joavn公司上海安亭仪器公司上海康诚和美国revco公司美国mve公司美国nalgene公司上海一恒科技德国leica公司德国falcon公司绍兴医疗器械厂n02120max219电子天平navigator公司分析天平倒置相差显微镜6孔细胞培养板24孔细胞培养板血球计数器微孔滤膜上海天平仪器厂丹麦nunc公司德国leica公司丹麦nmnc公司丹麦nmnc公司绍兴医疗器械厂美国hlt公司德国eppendorf公司实时荧光定量pcr仪美国应用生物系统公司普通pcr仪流式细胞仪德国whatmanbiometra公司美国bd公司浙江理t大学硕十学位论文minispin离心机56烘箱冰箱214主要试剂配制1不含ca2m92的pbs溶液
浙江理工大学硕士学位
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｏｒ ｃｏｌｏｎ
ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｈａｖｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｎｅ ｏｒ ｍａｎｙ ｅｎｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｔａｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｈａｔ ｉｓ ａｌｓｏ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｗｉｌｌ ｆｏｒｍ ｎｅｗ ｍａｔｕｒｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ，