固定化牛血清白蛋白吸附材料的制备及其对胆红素的吸附性能

固定化牛血清白蛋白吸附材料的制备及其对胆红素的吸附性能于志远;吴仁安;邹汉法
【摘要】降低高胆红素血症和重症肝炎患者血液中异常升高的胆红素浓度是血浆交换和血液灌流等疗法的目标之一.本文通过共价键合的方法将牛血清白蛋白(BSA)固定在甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯[poly(GMA-co-TMPTMA)]大孔树脂微球上,制备得到对胆红素具良好吸附性能的固定化BSA吸附材料(BIA),吸附容量达48.7 mg/g.由于血清白蛋白对胆红素的强烈相互作用,胆红素溶液中游离BSA的存在会显著降低BIA对胆红素的吸附量.BIA对胆红素的吸附量随吸附温度升高而增加.BIA在-80 ℃下储存31 d后性能仍然稳定,对胆红素的吸附量几乎不变.上述结果表明所制备的BIA为以特异性吸附胆红素为目的的血液净化材料提供了新的选择.
【期刊名称】《色谱》
【年(卷),期】2010(028)003
【总页数】5页(P291-295)
【关键词】吸附材料;牛血清白蛋白;微球;胆红素
【作者】于志远;吴仁安;邹汉法
【作者单位】中国科学院分离分析化学重点试验室,中国科学院大连化学物理研究所,国家色谱研究分析中心,辽宁,大连,116023;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院分离分析化学重点试验室,中国科学院大连化学物理研究所,国家色谱研究分析中心,辽宁,大连,116023;中国科学院分离分析化学重点试验室,中国科学院大连化学物理研究所,国家色谱研究分析中心,辽宁,大连,116023
【正文语种】中文
【中图分类】O658
Abstract:Serumbilirubin concentration is greatly elevated in certain diseases such as hyper biliru binemia and severe hepatitis.Lowering the level of bilirubin is one of the major targets of m any therapies such as plasma exchange and hemoper fusion.In this study,a bilirubin specific adsorbent was p repared by covalently immobilizing bovine serum album in(BSA)onto macroporouspoly(glycidyl methacrylate-co-trimethylol propanetrimethacrylate)microspheres.The resulting BSA immobilized adsorbent(B IA)demonstrated good perform ance in adsorp tion of bilirubin with an adsorption capacity of48.7m g/g.Presence of BSA in bilirubin solution significantly lowered the adsorption capacity of the adsorbent due to the tight binding of bilirubin onto BSA.Adsorption performance of the adsorbent for bilirubin was improved with the elevation of temperature.The adsorbent demonstrated good stability even after31d of storage at-80℃in that there was almost no change in adsorption capacity for bilirubin.These results indicated that the prepared BSA immobilized adsorbent could be an alternative choice for specific adsorption of bilirubin.
Key words:adsorbent;bovine serum album in;microspheres;bilirubin
胆红素(bilirubin)是血红素的代谢产物,在血浆中它与血清白蛋白结合并被运送到肝脏进行代谢[1]。

血浆内胆红素浓度是肝功能检查的一项重要生理指标,它反映了肝脏吸收、代谢胆红素的能力。

在新生儿高胆红素血症和黄疸等疾病中胆红素会出现
浓度升高的症状[2,3];重症肝炎和肝功能丧失患者体内胆红素浓度升高也十分常见,严重时会导致肝性脑病和核黄疽等并发症[4],所以降低胆红素浓度是血浆灌流等血液净化疗法的重要目标[5,6]。

活性炭、中性树脂和阴离子交换树脂等材料都曾被用于对胆红素的吸附[7-10],但这些材料对胆红素都是非选择性的吸附,在去除胆红素的过程中同时也会吸附人体血液中的正常浓度的成分。

研发可选择性吸附胆红素的材料是当前血液净化材料研究与应用的热点,其中多肽型、牛血清白蛋白(BSA)涂敷型、人血清白蛋白(HSA)键合型和染料键合型吸附材料的研究已见报道[11-15]。

近年来,基于蛋白透析技术的分子吸附材料被用于去除与白蛋白结合的内毒素[16],如胆红素和胆汁酸等。

然而由于HSA来源较少且价格昂贵,而BSA来源广泛,价格低廉,最主要的是BSA具有与HSA相似的吸附功能,可与胆红素发生特异性的相互作用,因此本文将BSA通过共价键固定于甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯[poly(GMA-co-TM PTMA)]微球上,制备得到一种对胆红素有特异性吸附作用的固定化BSA吸附材料(B IA),并对其吸附性能进行了评价。

V-550型紫外-可见分光光度计(JASCO,日本),超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所),恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司),高速控温离心机(B eckm an Coulter,美国)。

BSA(98%)、苯乙烯(99%)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA,97%)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TM PTMA,工业级)和羰基二咪唑(CD I,90%)购自Sigm a公司。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP,相对分子质量(Mr)40 000)和聚乙烯醇(PVA,水解度:86%～89%,Mr57 000～66 000)购自A lfa Aesar公司。

胆红素(99%)和聚乙二醇辛基苯基醚(triton X-100,98%)购自Acros公司。

偶氮二异丁腈(A IBN)、十二烷基硫酸钠(SDS)和无水乙二胺等试剂均为分析纯。

实验用水均经过M illi-Q系统净化。

将1.248g PVP、1.2g triton X-100、16mL苯乙烯和580m g A IBN加入盛有
64mL无水乙醇的圆底烧瓶中,室温下以100r/m in速率机械搅拌15 m in。

然后
将烧瓶置于70℃油浴中,在氮气保护下100r/m in机械搅拌24h。

得到的聚苯乙烯微球用乙醇洗涤3次后60℃真空干燥备用。

将8.064g GMA、6.336g TM PTMA、144m g A IBN和14.4g甲苯混溶后加入
含有10g/L PVA和2.5g/L SDS的150mL水溶液中,得到的油水两层溶液使用超
声波细胞破碎机超声乳化,得到乳浊液。

将0.45g聚苯乙烯微球悬浮分散于15mL
含有10g/L PVA和2.5g/L SDS的水溶液中,然后将其加入到上述乳浊液中,在30℃下以150r/m in速率机械搅拌溶胀12h。

溶胀后升温至70℃聚合。

得到的
poly(GMA-co-TM PTMA)微球分别用四氢呋喃和丙酮洗涤3次后60℃真空干燥
备用。

8g poly(GMA-co-TM PTMA)微球悬浮分散于盛有60mL无水乙二胺的圆底烧瓶中,然后将烧瓶置于90℃的油浴中磁力搅拌3h,得到的胺化微球用水和乙醇分别洗
涤3次后60℃真空干燥。

5g干燥的胺化微球悬浮分散于60mL含有2g CD I的
乙腈中,室温下以150r/m in速率机械搅拌8h,所得微球用乙腈洗涤除去未反应的CD I,并悬浮分散于100mL含有2g BSA的1mmol/L N aH2PO4(pH 7.0)缓冲液中,室温下以150r/m in速率机械搅拌24h。

所得固定化BSA微球用含有
2mmol/L N aCl的50mmol/L N aH2PO4(pH7.0)缓冲液洗涤3次除去未反应的BSA,然后依次用50mmol/L N aH2PO4(pH7.0)缓冲液和1mmol/L N
aH2PO4(pH7.0)缓冲液洗涤3次,得到的固定化BSA微球经冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中待用。

1.5.1 胆红素标准曲线的绘制
胆红素溶液配制过程采取避光措施,在暗室中操作。

5m g胆红素溶解于
2mL0.1mmol/L N a2CO3和4mL二甲基亚砜中,用50mmol/L N aH2PO4缓冲
液(pH7.8)定容于100mL容量瓶中,得到50m g/L胆红素溶液。

然后将其用空白溶
液稀释,得到一系列不同质量浓度的胆红素溶液,并用V-550型紫外-可见分光光度计在438nm处测量其吸光值,并绘制胆红素溶液的标准曲线。

含BSA的胆红素(ABB)溶液(BSA∶胆红素=1∶2,摩尔比)标准曲线的绘制与上述过程相同。

1.5.2 B IA的胆红素吸附量的测定
按1.5.1节所述方法配制质量浓度从100 m g/L到250m g/L的胆红素溶液。

称取30m g B IA,加入到装有6mL胆红素溶液的10mL离心管中。

离心管用铝箔包裹避光,置于37℃恒温培养振荡器中在200r/m in下振荡2h,然后取出在5
000r/m in下离心,取上清液在438nm波长下测其吸光值,由胆红素标准曲线计算吸附后胆红素溶液的质量浓度。

胆红素的吸附量使用下面的公式计算:
其中Q(m g/g)为吸附量,C0(m g/L)和C(m g/L)为吸附前后胆红素溶液的质量浓度,V(L)是胆红素溶液体积,m(g)是吸附材料的质量。

B IA对ABB溶液(BSA∶胆红素=1∶2,摩尔比)中的结合态胆红素的吸附容量的测定方法与上述过程相似。

1.5.3 温度对B IA吸附性能的影响
将30m g B IA加入到装有6mL250m g/L胆红素溶液的离心管中,离心管用铝箔包裹避光,置于37℃恒温培养振荡器中以200r/m in速率振荡,在不同的时间点取出其中一个离心管,以5 000r/m in的速率离心,测定上清液在438nm波长处的吸光值并计算胆红素的质量浓度。

用同样的方法测量B IA对ABB溶液中结合态胆红素的吸附性能,所使用的ABB溶液的质量浓度为200m g/L(BSA∶胆红素=1∶2,摩尔比)。

改变吸附温度,重复上述实验过程,测定B IA在25℃条件下对胆红素的吸附性能。

1.5.4 B IA稳定性考察
将所制备的B IA储存在-80℃冰箱中。

在储存31d之后,重新考察B IA在37℃时对胆红素的吸附性能。

本文使用一步乳液溶胀聚合法制备poly(GMA-co-TM PTMA)微球作为吸附材料
的基质,该方法是在U gelstad等[17]发明的两步溶胀法(twostep sw elling p rocess)基础上改进而来。

具体过程如下:将单分散聚苯乙烯微球为种子,在由单体、交联剂和致孔剂组成的乳浊液中溶胀,溶胀过程中聚苯乙烯种子微球吸收单体、交
联剂和致孔剂而直径变大,溶胀结束后升温聚合,从而制备出更大尺寸的聚合物微球。

上述过程中所使用的单分散聚苯乙烯种子微球采用分散聚合法制备,具体制备过程
与Paine等[18]所描述的过程相同。

因为在制备聚苯乙烯种子微球的过程中没有使用致孔剂,所以聚苯乙烯微球是无孔的。

扫描电子显微镜显示所制备聚苯乙烯微球
尺寸呈单分散特点,直径约为4.9μm(如图1所示)。

通过一步乳液溶胀聚合法所制备得到的poly(GMA-co-TM PTMA)微球尺寸同样
呈现单分散特点,直径约14μm(如图2所示)。

poly(GMA-co-TM PTMA)微球的孔结构表征结果如表1所示。

poly(GMA-co-TM PTMA)微球上的环氧基团通过开环反应与乙二胺反应从而在微球上引入胺基,BSA的固定化是通过CD I与BSA上的胺基和微球上的胺基反应实现。

反应过程如图3所示。

用元素分析法测量中间产物胺化微球和最终产物B IA上的含氮量,二者的差值用于计算B IA上BSA的固载量[19],测量和计算结果如表2所示,其中B IA上BSA的
固载量为68.12m g/g。

本文采用标准曲线法测定吸附后胆红素溶液的质量浓度,胆红素溶液标准曲线和ABB溶液的标准曲线均有较好的线性。

以胆红素溶液在438nm处的吸光值为纵
坐标Y,以胆红素的质量浓度为横坐标X(m g/L),则胆红素溶液和ABB溶液的标准
曲线分别为Y=-0.041 24+0.089 34X(r=0.999 2)和Y=0.022 54+0.083
66X(r=0.999 4)。

实验中还考察了B IA对不同质量浓度溶液中胆红素的吸附性能,结果如图4所示。

B IA的胆红素吸附量随胆红素浓度上升而增加,同时B IA对胆红素的去除率一直保持在95%以上,当胆红素质量浓度为250m g/L时,B IA对胆红素的吸附量为48.7m g/g,该结果表明B IA对溶液中游离的胆红素具有良好的吸附性能。

在人体血液中,胆红素结合在HSA上,然后被转运到肝脏进行代谢,吸附材料要吸附和去除的就是结合在HSA上的胆红素。

HSA稀有昂贵,而BSA来源广泛,价格低廉,最主要的是BSA具有和HSA十分相似的胆红素结合转运功能,因此溶液中游离BSA对胆红素的结合对B IA性能的影响应该和HSA的影响相似。

一个HSA分子通常可以牢固地结合两个胆红素分子,另外可以松散地结合9～13个胆红素分子[11]。

我们将BSA和胆红素以1∶2的摩尔比混合后配制了ABB溶液,考察B IA对结合态胆红素的吸附效果。

实验结果表明,溶液中的游离BSA对胆红素分子强烈的结合作用导致B IA对结合态胆红素的吸附性能大大低于对游离态胆红素的吸附性能,结果如图5所示。

图5显示,B IA对结合态胆红素的吸附量随样品溶液中胆红素质量浓度的上升而增加,然而,BSA对胆红素的去除率从初始的57%下降到了34%,这表明随着ABB溶液中胆红素质量浓度的增加,B IA对胆红素吸附量也随之增加,但是将逐渐达到饱和吸附量。

当ABB溶液的质量浓度为200m g/L时,B IA对胆红素的吸附量为13.5m g/g。

相比于B IA对游离胆红素的吸附量(48.7m g/g),不难发现ABB溶液中游离的BSA对胆红素的强烈结合作用使得B IA对胆红素的吸附量大大下降。

吸附胆红素的过程是B IA竞争性的将胆红素从ABB溶液中游离BSA的结合位点上吸附下来的过程,我们可以通过优化B IA的合成过程,增加BSA固载量的方法,增加B IA上胆红素结合位点,达到增大胆红素吸附量的目的。

本文同时考察了温度对吸附胆红素的影响。

通常情况下吸附质在吸附材料上的吸附量将随温度上升而下降,因为大多数吸附过程为放热过程。

然而对于胆红素的吸附情况相反。

文献报道过胆红素的吸附量随温度的上升而增加的现象[15,20]。

本文
考察了B IA在37℃和25℃的胆红素吸附性能,结果如图6和图7所示。

我们的实验结果同样表明B IA在较高的温度(37℃)会吸附更多的胆红素。

对于这种现象,一种假设认为,在较高的温度下,胆红素分子的构型从顺式转为反式,导致B IA在吸附胆红素时的空间位阻降低[20],从而导致吸附量增加。

B IA的稳定性是考察其最终能否实际应用于胆红素吸附的重要性质。

本文考察了B IA在储存于-80℃冰箱中31d之后对于游离态胆红素和结合态胆红素的吸附量,结果表明,新制备的B IA对游离态胆红素和结合态胆红素的吸附量分别是48.7和13.5m g/g,在31d之后对二者的吸附量分别为48.1和13.8m g/g,B IA对游离胆红素和结合态胆红素的吸附量几乎不变,该结果表明所制备的B IA在-80℃冰箱中存储31d之后仍然保持了良好的稳定性。

通过共价键合法将BSA分子固定于大孔高分子微球基质上,得到一种对胆红素具有特异性吸附性能的新型胆红素吸附材料B IA。

由于BSA和
HSA同样对胆红素具有强烈的特异性吸附,使得所制备的B IA表现出良好的胆红素特异性吸附性能;
同时,B IA在-80℃冰箱中存储31d之后仍然保持了良好的稳定性,且BSA价格低廉,使得所制备的吸附材料成本较低。

这些特点使得B IA成为胆红素吸附材料的一个新的选择。

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