人教版高中生物课件选修一血红蛋白的提取和分离PPT
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凝胶：
是由多糖类化合物分子（如葡聚糖或琼脂糖）在 一定的条件下互相交联在一起构成的多孔小球体 （凝胶粒），内部有许多贯穿的通道。
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
凝胶色谱法（分配色谱法）
凝胶色谱法的原理
①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量 较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长， 移动速度较慢;
2. 血液有哪些成分？
水分
血浆
血
其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
液 血细 胞
白细胞 血小板
红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
二、实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处本理课：题可选用猪、牛、羊或其他脊椎
透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白 色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶 液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉 淀层（暗红色）。 ③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
实验操作
2、血红蛋白的粗分离----透析：
①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透 析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l
动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤:
①洗涤目去的除: 杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化。 ②洗涤操1、作采：集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血 液凝固。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长， 会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效 果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水 洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液 洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复三次， 直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。
二、实验操作
(2)血红蛋白的加释蒸放馏：水到原血液体积，再加40％体积 的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速 细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以
2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色
50cm高
装配好的凝胶柱
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液 缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的 顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加 样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样 品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭 下端出口。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸 缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端 出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用 试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。
（2）凝胶色谱柱的装填
④洗涤平衡：装填完毕后， 立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的操作压下，用 300ml的20mmol/l的磷酸缓 冲液（pH为7.0）充分洗涤平 衡12小时。注意：1、液面不 要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的 流动与最终生物大分子物质的 分离效果。2、不能发生洗脱 液流干，露出凝胶颗粒的现象。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取 一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后， 配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装 置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的 装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填 装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝 胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存 在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降 低分离效果。
凝 胶 色 谱 柱
凝胶电泳法 电泳 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细 胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核பைடு நூலகம்含有DNA，便于进行DNA的提 取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富， 便于提取血红蛋白。
教学目标 1. 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 2. 了解缓冲液的组成及其作用 3. 血红蛋白的分离－－样品处理 教学重点 4. 凝胶色谱法的原理 教学难点 5. 电泳法分离大分子的原理
分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不 同物理或化学性质的生物大分子。
凝胶色谱法（分配色谱法）
的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。
② 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大 分子保留在袋内。
透析过程动画演示
3、分离纯化血红蛋白---凝胶色谱操作:
（1）凝胶色谱柱的制作：
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度， 膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克 凝胶膨胀时吸水7.5克。
②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通 道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较 快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲 液，促使蛋白质分子的差速流动。
是由多糖类化合物分子（如葡聚糖或琼脂糖）在 一定的条件下互相交联在一起构成的多孔小球体 （凝胶粒），内部有许多贯穿的通道。
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
凝胶色谱法（分配色谱法）
凝胶色谱法的原理
①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量 较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长， 移动速度较慢;
2. 血液有哪些成分？
水分
血浆
血
其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等
液 血细 胞
白细胞 血小板
红细胞
两个α－肽链 血红蛋白 两个β一肽链
（最多） （90％） 四个亚铁红素基团
二、实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处本理课：题可选用猪、牛、羊或其他脊椎
透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白 色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶 液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉 淀层（暗红色）。 ③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
实验操作
2、血红蛋白的粗分离----透析：
①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透 析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l
动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤:
①洗涤目去的除: 杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化。 ②洗涤操1、作采：集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血 液凝固。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长， 会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效 果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水 洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液 洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复三次， 直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。
二、实验操作
(2)血红蛋白的加释蒸放馏：水到原血液体积，再加40％体积 的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速 细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以
2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色
50cm高
装配好的凝胶柱
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液 缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的 顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加 样，同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样 品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭 下端出口。
④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸 缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端 出口进行洗脱。
⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用 试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。
（2）凝胶色谱柱的装填
④洗涤平衡：装填完毕后， 立即用缓冲液洗脱瓶，在 50cm高的操作压下，用 300ml的20mmol/l的磷酸缓 冲液（pH为7.0）充分洗涤平 衡12小时。注意：1、液面不 要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的 流动与最终生物大分子物质的 分离效果。2、不能发生洗脱 液流干，露出凝胶颗粒的现象。
②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取 一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后， 配成凝胶悬浮液。
③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装 置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的 装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填 装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝 胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存 在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降 低分离效果。
凝 胶 色 谱 柱
凝胶电泳法 电泳 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。
1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细 胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核பைடு நூலகம்含有DNA，便于进行DNA的提 取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富， 便于提取血红蛋白。
教学目标 1. 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 2. 了解缓冲液的组成及其作用 3. 血红蛋白的分离－－样品处理 教学重点 4. 凝胶色谱法的原理 教学难点 5. 电泳法分离大分子的原理
分离生物大分子的基本思路：
选用一定的物理或化学的方法分离具有不 同物理或化学性质的生物大分子。
凝胶色谱法（分配色谱法）
的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。
②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。
② 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大 分子保留在袋内。
透析过程动画演示
3、分离纯化血红蛋白---凝胶色谱操作:
（1）凝胶色谱柱的制作：
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度， 膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克 凝胶膨胀时吸水7.5克。
②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通 道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较 快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。
凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲 液，促使蛋白质分子的差速流动。