拉下实验

瞬时作用
• 瞬时作用关系是由蛋白质瞬时作用引起的 • 瞬时作用主要发生在转运和酶反应过程中 • 通常需要加入辅因子+未水解的NTP类似物 来捕获依赖辅因子和NTP的猎物蛋白
七 洗脱
• 洗脱复合物 • 1 SDS——PAGE加样缓冲液（变性蛋白 质） • 2 钓饵蛋白标记物的特异竞争性分析物 （非变性蛋白质） • 3 盐浓度梯度上升、PH梯度下降
四 实验步骤
• • • • • • 1 将裂解物中带有融合标签的诱饵蛋白固定 2 洗脱未结合的蛋白质（离心 旋转） 3 猎物蛋白与固定的钓饵蛋白相结合 4 洗脱未结合的蛋白质 5 洗脱相互作用的蛋白质复合物 6 SDS——PAGE胶上分析相互作用的蛋白 质
五 钓饵蛋白的来源
• 1 传统纯化法纯化所得的蛋白质连接 上一个亲和标记
• 2 表达重组的融合蛋白
六 稳定作用关系与瞬时作用关系 • 蛋白质之间的作用可能是稳定的也 可能是瞬时的
• 瞬时作用通常与转运或酶催化有关
稳定作用
• 稳定的蛋白质的相互作用关系最容易用拉 下实验分离 • 这种蛋白质的相互作用构成了细胞结构， 蛋白质之间的解离常数低，蛋白质之间作 用强。 • 可用大量的高离子缓冲液洗涤 • 相反如果解离常数高，则通过PH、盐类型、 浓度条件的优化来提高蛋白质复合物的回 收效果
拉下实验
一概念
• 拉下实验是一种在体外研究两种或 多种蛋白质之间物理性相互作用的 方法
二 拉下实验的目的
• 作为验已知蛋白作用关系的一手 段
• 作为发现未知蛋白作用关系的一种 手段
三
实验原理
• 该实验本质是一种亲和纯化法 • 在一个下拉实验中，标记的钓饵蛋白可被 固定在特异化的亲和配体上 • 形成能够纯化与钓饵蛋白相作用的其他蛋 白质的二级亲和基质 • 再将钓饵蛋白的二级亲和基质与一系列猎 物蛋白一起温浴 • 然后采用适当的洗脱方法洗脱目标蛋白
八 钓饵-猎物蛋白复合物的凝胶电泳检测
• 洗脱下来的蛋白质复合物可经SDS-PAGE 显示出来（及凝胶染色、Western杂交、 S35放射性同位素等方法） • 聚丙烯胺凝胶中蛋白质带的回收 • 胰蛋白酶消化 • 消化片段的质谱分析 • 鉴定
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