高脂饮食联合小剂量STZ诱导2型糖尿病大鼠及小鼠模型眼表角膜病变的形态学观察

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｏｒｎｅａ ｏｆ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ＳＴＺ ａｎｄ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｉｍａｌｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐｓ．Ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ＳＴＺ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｔｙｐｅ ２ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ａｆｔｅｒ １６／１２ｗｅｅｋｓ，ｆａｓｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｘｉｄａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞０．０５）；ｂｕｔ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ，ｆａｓｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ （Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｓｔｒｏｍａ ｉｎ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｅｄｅｍａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ ａｎｄ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｏｆ ＳＴＺ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｈａｖｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｎｅａ ａｆｔｅｒ １６／１２ ｗｅｅｋｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｙｐｅ ２ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ；ｄｉａｂｅｔｉｃ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ；ｏｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ；ｃｏｒｎｅａ
２ 结 果
２．１ 动物一般状 态、 体 质 量 及 摄 食 热 量 变 化 与 正常对照组比较，模型组动物精神萎靡，毛发稀落 发黄，粗糙欠光泽，三多一少症状明显，糖尿病症 状较 重。 大 鼠 模 型 建 立 第 １６ 周， 小 鼠 模 型 建 立 １２ 周 时 ， 各 组 体 质 量 及 摄 食 量 见 表 １， 正 常 对 照 组 与模型 组 动 物 体 质 量 差 异 无 统 计 学 意 义 （Ｐ ＞ ０．０５），而模型组大 鼠 及 小 鼠 的 摄 食 热 量 明 显 高 于 各自的正常对照组 （Ｐ＜０．０５）。 ２．２ 动 物 ＦＢＧ、ＴＧ 及 ＴＣ 变 化 与 ＣＯＮ１、 ＣＯＮ２比较，ＤＭ１ 及 ＤＭ２ 组 动 物 ＦＢＧ 水 平 均 显 著 增 高 （Ｐ ＜０．００１），ＴＧ 及 ＴＣ 亦 明 显 增 高
陈 立 （Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９７９９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｗｅｉｃｈｅｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）
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吉林大学学报 （医学版） 第３７卷 第６期 ２０１１年１１月
糖尿 病 是 以 糖 代 谢 紊 乱 为 主 的 常 见 全 身 性 疾 病，患病率逐年提高。糖尿病可引起眼部多种并发 症，近年来的临床资料观察到糖尿病患者出现眼干 涩、异物感、烧灼感的症状较普遍 。 ［１］ 糖尿病 可 导 致眼表的改变，包括泪膜、角膜上皮和角膜神经的 改变。糖尿病角膜并发症包括复发性角膜上皮再生 迟缓、浅点状角膜炎、持续性上皮缺损、反复的上 皮糜烂、浅层角膜溃疡、角膜知觉下降、内眼术后 持续性角膜 基 质 水 肿 等 。 ［２－３］ 糖 尿 病 角 膜 损 伤 与 糖 尿病类型、病程有关，目前国内实验研究所采用的 ２型糖 尿 病 模 型 多 为 高 脂 饮 食 联 合 链 脲 佐 菌 素 （ｓｔｒｅｐｔｏｚｏ ｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ） 诱 导 大 鼠 模 型， 然 而， 该 模型是否也可诱发糖尿病眼表并发症，且累及时间 及程度如何？目前国内外报道较少。另外，由该方 法所诱导的糖尿病小鼠模型并发眼病国内外均无详 细报道。本实验 通 过 以 ＳＴＺ 诱 导 成 糖 尿 病 大 鼠 及 小鼠模型，动态观察糖尿病模型角膜组织形态学变 化，为进一步认识糖尿病性眼表疾病发病机制提供 病理学基础。
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ＳＴＺ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｙｐｅ ２ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ
ＣＨＥＮ Ｈａｎ１，ＬＵ Ｘｉａｏ－ｙａｎ２，ＬＩ Ｗｅｉ ２，ＧＵ Ｊｉａｎ２，ＬＵ Ｘｉａｏ－ｈｅ１，ＣＨＥＮ Ｌｉ ２ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｚｈｕｊｉａｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０２８０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００２１，Ｃｈｉｎａ）
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材料及仪器 ＳＴＺ 购自 Ｓｉｇｍａ公司， 胰岛素 购自通化东宝药业，葡萄糖试剂盒、甘油三酯及总 胆固醇试剂盒均购自北京北化康泰公司。低温超高 速离心机购自 Ｔｈｅｒｍｏ 公司，紫外可见分光光度计 购自上海精密科学仪器有限公司。 １．２ 动 物 模 型 建 立 鼠 正 常 饲 料 含 有 ５％ 脂 肪， ５３％ 碳 水 化 合 物，２３％ 蛋 白， 总 热 量２５Ｊ·ｇ－１； 高脂饲料含有２２％ 脂肪，４８％ 碳水化合物，２０％ 蛋白，总热量 ４４．３Ｊ·ｇ－１。 正 常 及 高 脂 饲 料 均 购 自吉林大学白求恩医学院实验动物中心。动物均购 自吉林大 学 白 求 恩 医 学 院 实 验 动 物 中 心 （合 格 证 号：２００３－０００１）。 采 取 大 鼠 每 笼 ３ 只、 小 鼠 每 笼 ５ 只 饲 养 ， 并 维 持 １２ｈ∶１２ｈ 昼 夜 循 环 。 实 验 期 间 每天记录摄食量、每周记录体质量，并观察大鼠及 小鼠状态。①２型糖尿病大鼠 动 物 模 型 的 建 立： 健 康雄性 Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体质量２００～２２０ｇ，从２０ 只 大鼠中 随 机 取 ８ 只 为 正 常 对 照 组 （ＣＯＮ１）， 其 余 １２只为模 型 组 （ＤＭ１）。 正 常 对 组 大 鼠 喂 正 常 饲 料，模型组大鼠给予高脂饲料，４ 周 后 模 型 组 大 鼠 腹腔注 射 ＳＴＺ （３０ ｍｇ·ｋｇ－１）２ 次， 间 隔 １ 周； 正常对照组大鼠给予同 等 体 积 的 枸 橼 酸缓 冲 液。 ＳＴＺ 注射 ４ 周 后 大 鼠 禁 食， 剪 尾 取 血， 测 量 空 腹 血 糖 （ｆａｓｔｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ， ＦＢＧ ）， ＦＢＧ ＞
［收稿日期］ ２０１１－０８－０１ ［基金项目］ 国家自然科学基金资助课题 （３０７７２６０４） ［作者简介］ 陈 晗 （１９８５－），女，吉林省长春市人，在读医学博士，主要从事眼科学临床及基础研究。 ［通信作者］ 陆晓和 （Ｔｅｌ：０２０－６１６４３３９９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｘｉａｏｈｅ００１＠１２６．ｃｏｍ）；
陈 晗１，吕 晓 艳２，李 伟２，顾 建２，陆 晓 和１，陈 立２ （１．南方医科大学附属珠江医院眼科，广东 广州 ５１０２８０；２．吉林大学白求恩医学院药理学教研室，吉林 长春 １３００２１）
［摘 要］ 目的：探讨高脂饮食联合小剂量链脲佐 菌 素 （ＳＴＺ） 诱 导 的 ２ 型 糖 尿 病 大 鼠 及 小 鼠 模 型 眼 角 膜 形 态 学改变，阐明糖尿病并发眼部疾病时眼表角膜病变特征。方法：将动物随机分为模型组和正常对照组，高脂饮 食联合 ＳＴＺ腹腔注射建立大鼠及小鼠糖尿病模型。造 模 １６／１２ 周 后，氧 化 酶 法 检 测 空 腹 血 糖 水 平 ， 酶 法 检 测 血 游离脂肪酸及总胆固醇水平；动物处死后分离眼球，角膜 ＨＥ 染色并在光镜下观察其组织病理学改变。结果：与 正常对照组比较，模型组大鼠及小鼠体质量无 明 显 改 变 （Ｐ＞０．０５）， 但 摄 食 量、 空 腹 血 糖、 血 脂 水 平 均 显 著 升 高 （Ｐ＜０．０１）。与正常对照组比较，模型组大鼠及小鼠 角 膜 形 态 学 观 察 均 表 现 为 厚 度 明 显 增 加 ， 上 皮 层 及 基 质 层水肿明显。结论：高脂饮食联合小剂量 ＳＴＺ注射建 立 的 实 验 性 大 鼠 及 小 鼠 糖 尿 病 模 型 成 模 后 １６／１２ 周， 均 具 有明显的眼表角膜受损特征。 ［关键词］ ２型糖尿病；糖尿病眼病；眼表疾病；角膜 ［中图分类号］ Ｒ－３３２；Ｒ５８７．１ ［文献标志码］ Ａ
吉 林 大 学 学 报 （医 学 版 ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）
［文 章 编 号 ］ １６７１－５８７Ⅹ （２０１１）０６－１００１－０４
Ｖｏｌ．３７ Ｎｏ．６ Ｎｏｖ．２０１１
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高脂饮食联合小剂量ＳＴＺ 诱导２型糖尿病大鼠及小鼠 模型眼表角膜病变的形态学观察
角膜改变与糖尿病类型病程有关8本课题组成功建立了2型糖尿病大鼠及小鼠模型并观察角膜病变情况大鼠造模12周时并未出现角膜的明显病理学异常结果未展示因此本文作者继续延长造模时间在16周时观察大鼠角膜形态发现糖尿病组大鼠角膜厚度增加上皮层基底细胞水肿细胞排列较疏松基质层亦明显水肿
第 ３７ 卷 第 ６ 期 ２０１１ 年 １１ 月
Hale Waihona Puke ７．８ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 为 糖 尿 病 诊 断 标 准。ＳＴＺ 注 射 １６周后， 禁食１２～１６ｈ，乌拉坦 （１００ｍｇ·ｋｇ－１） 腹腔注 射 麻 醉， 腹 主 动 脉 取 血 并 处 死 动 物， 取 眼 球，中性甲醛固定。②２型糖尿 病 小 鼠 动 物 模 型 的 建 立 ： 健 康 雄 性 昆 明 种 小 鼠 ， 体 质 量１８～２２ｇ， 从 ３０只小鼠中 随 机 取 １０ 只 为 正 常 对 照 组 （ＣＯＮ２）， 其余２０ 只 为 模 型 组 （ＤＭ２）。 正 常 对 照 组 小 鼠 喂 正常饲料，模型组小鼠给予高 脂 饲 料，４ 周 后 模 型 组小鼠腹腔注射 ＳＴＺ （１００ｍｇ·ｋｇ－１）１次，正常 对照组 小 鼠 给 予 同 等 体 积 的 枸 橼 酸 缓 冲 液。ＳＴＺ 注射４周后小鼠禁食，剪尾取血，测量空腹血糖， ＦＢＧ＞７．８ｍｍｏｌ·Ｌ－１为 糖 尿 病 诊 断 标 准。ＳＴＺ 注 射 １２ 周 后， 禁 食 １２ ～ １６ ｈ， 乌 拉 坦 （１００ｍｇ·ｋｇ－１）腹腔 注 射 麻 醉， 腹 主 动 脉 取 血 并 处死动物，取眼球，中性甲醛固定。 １．３ ＦＢＧ、 总 胆 固 醇 （ＴＣ） 及 甘 油 三 酯 （ＴＧ） 的测定 实验结束后检测血清中 ＦＢＧ 及血脂水平。 血清 ＦＢＧ 通过 葡 萄 糖 氧 化 酶 法 测 定， 严 格 按 照 葡 萄糖试剂盒说明书进行，将试剂盒中的酶和酚试剂 按 照 说 明 书 等 比 混 合 后，３７℃ 反 应 １５ ｍｉｎ， ５４０ｎｍ处测定 吸 光 值。ＴＣ 和 ＴＧ 采 用 酶 法 检 测， 具体参照试剂盒说明书进行。 １．４ 角膜 ＨＥ 染色及 形 态 学 观 察 分 别 于 大 鼠 模 型 成 模 后 第 １６ 周 、 小 鼠 １２ 周 处 死 动 物 ， 立 即 取 下 大鼠、小鼠右眼球。标本经中性甲醛固定、乙醇脱 水、石蜡包埋、ＨＥ 染色后制 片， 在 光 学 显 微 镜 下 观察各组动物角膜形态。 １．５ 统计学分析 采 用 ＳＰＳＳ １０．０ 统 计 学 软 件 进 行统计学处理，体质量、摄食热量、ＦＢＧ 、ＴＧ 及 ＴＣ 水平以ｘ±ｓ表示，组间样本均数比较采用ｔ检 验。