《烟草及烟草制品中总植物碱的测定连续流动硫氰酸钾法》 试验报告doc

《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动硫氰酸钾法》
标准项目实验报告
1研究背景
生物碱是一类存在于生物体（主要是植物）中含氮的碱性有机化合物，也称为植物碱。

烟草中含有多种生物碱，按其分子结构分为两类，一类是吡啶与氢化吡咯环相结合的化合物，如烟碱（尼古丁）、去甲基烟碱（降烟碱）、去氢去甲基烟碱（麦斯明）、二烯烟碱（尼古替啉)等；另一类是吡啶环与吡啶或氢化吡咯环相结合的化合物，如新烟碱（阿那培新）、甲基新烟碱、去氢新烟碱（阿那他明）、N-甲基去氢新烟碱、2,3-二吡啶等。

烟草总植物碱是指烟草中所有的生物碱。

烟草生物碱以烟碱最重要，它占烟草生物碱总量的95%以上，其次是去甲基烟碱（降烟碱）、新烟碱等，故在测定烟草总植物碱的含量时，常以烟碱计。

过高的烟碱含量会严重影响烟叶品质，降低烟叶在卷烟配方中的可用性。

通过检测烟碱含量与烟叶厚度、种植密度的关系，可以在生产中降低烟叶烟碱含量，提高烟叶的可用性。

烟碱含量在医学上也是重要指标，可缓解和治疗多种疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病、神经衰弱、记忆衰退等。

目前，我国测定烟草及烟草制品中总植物碱的标准有两个，一个是GB/T 23225－2008《烟草及烟草制品总植物碱的测定光度法》；另一个是YC/T 160－2002《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》，它的主要内容与1994年国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）发布的35号推荐方法基本相同。

光度法专一性较强，对蒸馏回收率有严格要求，操作过程包括蒸馏和光度测定两步。

由于蒸馏装置的限制，每次测定的样品量有限，检测耗时较长，难以适应批量样品的检测要求，行业内采用该方法的单位不多。

相对光度法，连续流动法快速、简便、能同时测定烟草中多项指标，已被行业内各检测机构普遍采纳，是测定烟草及烟草制品中总植物碱含量的主要有效可行方法。

国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）1994年发布了35号推荐方法。

质检中心采纳制定现行的行业标准YC/T 160－2002《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》。

YC/T 160－2002虽然回避了溴化氰的很多缺陷，但是氰化钾也属于剧毒品，是重点危险源。

国家及地方安全管理部门对氰化钾的购买、使用、保存、废液保管与后期处理等均有严格规定，且随着我国安全管理的发展，管理力度的不断升级，相应的制度会越来越严格，该方法的应用受到了很大的限制。

另外，该方法存在严重安全
隐患，不仅给操作人员带来了使用危险，同时也给使用单位带来了管理风险，即，使用单位须建立专用危险品库房、设立专人管理及建立严格的管理与检查制度等，加大了成本和管理投入。

此外，烟草行业的质检机构大多需要进行实验室认可，其中就包括对毒品的管理和使用的严格考核，这增加了氰化钾法的使用难度。

和国内状况一样，国外也存在类似问题，所以国外许多烟草机构已开展了替代氰化钾的方法研究。

2011年，CORESTA化学常规分学组研究了用硫氰酸钾和次氯酸钠（或二氯异氰尿酸钠）反应代替氰化钾和氯胺T反应的研究。

该方法的原理是利用硫氰酸钾和次氯酸钠（或二氯异氰尿酸钠）在线反应生成氯化氰进行分析，相比氰化钾和氯胺T的反应，虽然其灵敏度≤50%，但是分析数据的准确度依然满足分析要求。

因为硫氰酸钾、次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠都是无毒的，该方法的安全性提高了一大步。

次氯酸钠为液体，不稳定，用前要滴定确定有效氯浓度，而二氯异氰尿酸钠为固体粉末，稳定性好，并且水解后有效氯能达到60～63%，用前不需要滴定，所以从实验操作和测试稳定性考虑，采用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠反应比较理想。

根据烟草行业的实际情况，本项目确定用连续流动分析仪测定烟草及烟草制品中总植物碱样品的种类及规格：①采用三种类型的烟叶样品：烤烟、白肋烟和香料烟；
②采用两种类型的卷烟样品：烤烟型、混合型。

样品统一由国家烟草质量监督检验中心提供，项目组从检测原理入手，对实验最佳条件进行优选，通过方法学研究考证，确定该方法的的检出限、重复性和回收率是否达到要求，并通过实验室间比对确定方法适用性，最终建立《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动硫氰酸钾法》行业标准，包括试样制备、设备及仪器规格、实验条件等各项具体技术指标及参数等，以便在烟草行业推广实行。

2 实验
2.1仪器和材料
BRAN＋LUEBBE AA3连续流动分析仪，BRAN＋LUEBBE 12英寸透析槽，C”型透析膜(德国布朗卢比公司)；HP8453型紫外一可见分光光度计(美国HP公司)；
BSA2245-CW电子天平(感量0.0001g，德国赛多利斯公司)；Milli一Element超纯水装置(美国Millipore公司)；DCIC（二氯异氰尿酸钠）(纯度>95.0 %，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司)、氯化钠、硼酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、对氨基苯磺酸、硫氰酸钾、硫酸亚铁、碳酸钠和冰乙酸(AR，天津北方天医化学试剂厂)；烟碱(纯度>98.0 %，国家
烟草质量监督检验中心提供)；烤烟，白肋烟，香料烟，烤烟型卷烟和混合型卷烟5类样品（国家烟草质量监督检验中心提供）。

2.2样品的前处理和分析
烟叶样品制备参照YC/T31-1996。

准确称取0.25g样品至50mL具塞三角烧瓶中，加入25 mL 5% 醋酸或去离子水，室温下振荡30min后过滤，使用连续流动分析仪测定，测定管路见图1。

图1 测定烟草中的总植物碱管路图
3 结果与讨论
3.1反应原理
3.1.1氯化氰在线合成的原理
二氯异氰尿酸钠的结构式如式1所示：
N
C
N C N
O O
O-Na+
Cl Cl
……………………（式1）在水溶液中二氯异氰尿酸钠将发生二级水解，此过程将释放出ClO-(提供氯源)，水解反应如式2所示：
N C N C
N
O
O
O -Cl
Cl
N C
N -C
N C O
O O H
H
+
2OH
-
2ClO -
+……（式2）
另一方面，硫氰酸钾在水溶液中绝大部分将电离为SCN -（提供氰源）。

所以二氯异氰尿酸钠水解产生的ClO -与硫氰酸钾电离产生的SCN -瞬间发生氧化还原反应产生目标化合物ClCN ，此反应方程如下所示：
ClO - + SCN - + H 2O + 2e = ClCN + S 2- + 2OH -
但是在ClCN 产生的过程中，伴随着副反应发生，如式3所示：
N C N -C
N
C
O
O
O
H
H
N
C
N C N C
O
O O H
H
+
H +
H
…………（式3）
此产物是异氰尿酸，属微溶性化合物，溶解度仅为0.27g ，容易在溶液中以白色沉淀析出，造成管路堵塞。

所以必须优化实验条件，控制异氰尿酸沉淀的析出。

3.1.2氯化氰在线合成控制的关键
二氯异氰尿酸钠通过二级水解反应会产生ClO -，此ClO -将与SCN -在线合成ClCN 。

但是，如果溶液中ClO -与SCN -比例大于1:1的话，将有ClO -剩余，ClO -在酸性环境中具有很强的氧化性，即使在中性环境中也具有一定的氧化性能，其两种环境下的标准电极电势如式4、5所示：
HClO + H + + 2e = Cl - + H 2O 1.482 V ……（式4） ClO - + H 2O + 2e = Cl - + 2OH - 0.89 V ……（式5） 而待测样品是植物碱，植物碱是供电化合物，在多数反应中提供电子，因此具有还原性能。

如果溶液体系中有多余的ClO -，并且体系环境偏酸性，其将与植物碱发生氧化还原反应，致使最终检测到的植物碱含量偏低。

综上原因，在ClO -与SCN -在线合成ClCN 这一过程中，要使溶液体系维持在中性环境，而且SCN -必须过量，避免ClO -剩余，造成最终结果偏低。

A.P. Brady 和Michael L. Pinsky 等人通过研究发现 SCN -:DCIC ≈ 3:1这一条件比较适合合成ClCN 。

本项目在保持
这个比例下，优化最适宜的试剂浓度，以此来达到检测目标化合物信号最大，管路不会有沉淀析出，同时使测量结果接近真实值的目的。

3.2定性分析实验
图2所示为不同浓度的标准样品和测试样品的紫外可见吸收光谱曲线。

根据反应原理，通过标准样品的测试结果来建立标准曲线，然后以标准曲线来推断待测样品的浓度。

从图2可以判断光谱的最大吸收波长为463nm，由于仪器配套滤光片的波长基本都是10的倍数，故本实验使用的是460nm滤光片。

图2 不同浓度标准样品和测试样品的紫外可见吸收光谱曲线
3.3萃取剂及萃取时间的选择
由于本方法主要是替换氰化钾与氯胺T试剂，其它试剂保持不变，YC/T 160－2002《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动法》的方法在制定过程中已进行过萃取剂及萃取时间的实验，因此本方法直接采用水或5%醋酸溶液对样品进行萃取，不再进行萃取剂及萃取时间的实验。

3.4缓冲溶液B条件实验
本方法反应原理是萃取液中的总植物碱（以烟碱计）与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，反应物用比色剂在460nm测定。

根据Sadeler和Harvey等人的研究结果，该方法的最佳反应pH值为7.0，最大吸收波长为460nm。

YC/T 160所使用的试剂PH 见表1
表1 YC/T 160所使用的试剂PH
由于本方法采用硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠在线反应生成氯化氰，硫氰酸钾的PH 为4.97，二氯异氰尿酸钠的PH为5.27，这两种溶液混合后会影响整个反应的酸碱环境。

经过实际测定，洗针液为5%醋酸时，进入检测器溶液的PH为5.20；洗针液为水时，进入检测器溶液的PH为6.22，均不在最佳反应pH值，因此需要对缓冲溶液B进行调整。

由于缓冲溶液B配置使用了磷酸氢二钠，通过调整该物质的质量可以调整缓冲溶液B的PH，调整情况见表2。

由表2可知当缓冲溶液B中12水合磷酸氢二钠质量为262（g/L）时，进入检测器溶液PH可达到最佳反应pH的要求，因此本方法缓冲溶液B配置为：称取262g 十二水合磷酸氢二钠，10.4g 一水合柠檬酸，7g对氨基苯磺酸，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1 mL Brij 35，用蒸馏水稀释至1L。

使用前用定性快速滤纸过滤。

表2 缓冲溶液B调整实验
3.5硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠条件实验
3.5.1最佳浓度条件实验
硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠实验浓度见表3
表3 硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠浓度
烤烟型卷烟和混合型卷烟进行条件实验结果见表4～表8。

表4 烤烟条件实验
表5白肋烟条件实验
表6 香料烟条件实验
表7 烤烟型卷烟条件实验
表8 混合型卷烟条件实验
由表4～表8数据可以发现A2-B1和A3-B2条件最佳，这种情况与A.P. Brady和Michael L. Pinsky等人的研究成果一致，即SCN-:DCIC ≈ 3:1为最佳配比，由于本方法生成的氯化氰必须过量，因此本方法选择硫氰酸钾和二氯异氰尿酸钠浓度的最佳配比为A3-B2，即SCN-:DCIC=2.88g:2.20g=0.12mol/L: 0.04mol/L。

3.5.2管路条件
考虑到二氯异氰尿酸钠和硫氰酸钾的反应体系信号比氰化钾和氯胺T的弱，选择0.32mL/min的黑黑泵管，将在线生成的氯化氰压入反应体系。

实验中发现，在走上10个样品杯后，管路中生成白色沉淀，实验无法进行，故选择比氰化钾和氯胺T反应体系的管径略大的0.23mL/min的橙白泵管压入在线生成的氯化氰，一周连续每天测试230个样品，未发现白色沉淀堵塞管路。

3.6标准曲线
将所配制的标准溶液由高浓度到低浓度（0.5 ～7%）进行分析。

烟碱的响应值（Y，%）对相应的分析物浓度（x，%）进行线性回归，得到烟碱的回归方程和相关系数（见表9），结果表明，所烟碱在0.5 ～7%的浓度范围内均有良好的线性关系。

表9 烟碱的标准曲线方程和相关系数
3.7检出限
连续流动分析方法的检出限是根据美国环境保护局（EPA）方法part136 apendix B 来确定的。

EPA方法应用广泛，容易重复测试，用一连串的最高浓度标准工作溶液的
2%浓度溶液10个重复测量3次，得到标准偏差再乘以相应t值，即MDL(method detection limit) = (s) * (t-value)= (s) * t(n-1, .99)。

标准品10个，自由度为9，t(9, .99)=2.821，即MDL= 2.821 *(s)，得到的结果值表示方法检出限具有99% 可信度。

定量限的计算是LOQ（Limit of Quantitation）= 10 * (s)。

按氰化钾法和硫氰酸钾法，配置最高浓度标准工作溶液的2%浓度溶液10份，每份重复测量3次，按EPA方法计算得到方法的检出限和定量限，结果见表10、表11。

表10 氰化钾法的检出限和定量限
表11 硫氰酸钾法的检出限和定量限
氰化钾法的检出限和定量限分别为0.063%和0.220%，硫氰酸钾法的检出限和定量限0.045%和0.160%，两方法均达到检测要求。

3.8方法的精密度
采用本方法分别对样品烤烟、白肋烟、香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟样品进行6次平行测定，结果见表12。

由结果可以看出硫氰酸钾法的精密度可以满足总植物碱测定的要求。

表12 硫氰酸钾法的精密度测定结果
3.9不同萃取液萃取结果比较
由于YC/T 160规定5%醋酸或水萃取样品均可，因此采用本方法萃取液分别使用5%醋酸和水对样品烤烟、白肋烟、香料烟、烤烟型卷烟)和混合型卷烟样品进行测定，结果见表13。

对表13的结果进行配对t检验，结果为t=1.45，t0.05=2.78，t＜t0.05，说明两种萃取液提取烟草样品的结果没有显著性差异，因此采用本方法使用5%醋酸或水萃取样品可得到相同的结果。

表13 不同萃取液样品测试结果
3.10回收率
分别称取样品烤烟、白肋烟、香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟样品，分别按样品含量的75%、100%、125%进行加标，每个加标浓度3个平行。

加标后的样品分别按本方法前处理方法处理样品，在相同仪器分析条件进行样品分析，并由原含量、加标
量以及测定量计算回收率，结果见表14～表16。

从表14～表16可知，硫氰酸钾法测得的五种烟草类型烟碱的加标回收率平均值在98.06%～100.25%之间，表明该方法满足检测要求。

表14 75%加标回收率
表15 100%加标回收率
表16 125%加标回收率
3.11不同方法比对
将烤烟、白肋烟、香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟五个样品，分别采用氰化钾方法和硫氰酸钾的测定结果进行比较，结果见表17，同一样品采用硫氰酸钾测定结果相对于氰化钾法的相对误差均小于5%。

对同一样品分别采用硫氰酸钾或氰化钾方法的两组测定结果进行配对t检验，结果为t=1.39，t0.05=2.78，t＜t0.05，说明两种分析方法没有显著性差异，表明硫氰酸钾法与氰化钾方法结果一致。

表17 硫氰酸钾法与氰化钾法测定总植物碱结果对比
3.12实验室间比对
国内6家实验室对烤烟、白肋烟、香料烟、烤烟型卷烟和混合型卷烟样品七个样品按照硫氰酸钾法进行三平行测定，结果见表18。

项目组测定结果（实验室1）与5个实验室（实验室2-6）各个样品测定结果均值之间双边t检验结果见表19，可以看出国内5家实验室与项目组结果不存在显著性差异。

对表18的数据进行统计分析得到各样品的r 和R，见表20。

由表20的数据可以看出硫氰酸钾法的r和R与Coresta35号推荐方法（氰化钾方法）的r和R类似，说明本方法重复性和再现性可以满足总植物碱测定的需要。

表18 国内实验室测定结果
表19 项目组测定结果与5个实验室测定结果均值之间双边t检验结果
表20 国内比对实验统计结果
6、结论
项目组研究并论证了《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动硫氰酸钾法》方法的氯化氰反应原理，氯化氰在线合成控制的关键，定性分析实验，硫氰酸钾和DCIC 条件实验，方法的检出限、回收率，进行了不同方法的比对，并对方法的重复性和再现性进行了充分的论证。

通过以上的研究最终建立了《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动硫氰酸钾法》，该方法达到了国内现今的发展水平，可以替代氰化钾的方法。

建议将本方法作为推荐性行业标准方法。

《烟草及烟草制品总植物碱的测定连续流动硫氰酸钾法》项目组
2012.4。