南方红豆杉内生放线菌的分离鉴定和次级代谢潜力评估

南方红豆杉内生放线菌的分离鉴定和次级代谢潜力评估
罗红丽;关菲菲;沈兰;黄长武;李丹;胡昌华;廖国建
【摘要】目的以南方红豆杉茎和叶为材料分离内生放线菌,并对分离菌株进行分类、抗菌活性和次级代谢产物合成相关基因开展研究.方法样品经严格的表面消毒,选用3种培养基分离南方红豆杉内生放线菌;分离菌株通过形态观察和16S RNA序列分析进行分类鉴定;使用琼脂移块法测试分离菌株的抗菌活性;通过PCR检测分离菌株的PKS-I/NRPS、卤化酶和P450酶基因.结果从3个样品中获得了6株内生放线菌,属于链霉菌属(Streptomyces)和小单孢菌属(Micromonospora).部分分离菌株具有抗菌活性,其中1株对耐药金黄色葡萄球菌有拮抗活性,6株具有NRPS基因,2
株具有PKS-Ⅰ基因,1株具有P450酶基因和卤化酶基因.生物信息学分析表明,卤化酶和P450基因与Complestatin生物合成簇中相应基因有高达81％和95％一致性,暗示内生放线菌具有合成这种重要抗HIV活性化合物的潜力.结论南方红豆杉
作为一种重要药用植物,其内生放线菌以链霉菌和小单孢菌为主,有很好的合成次级
代谢产物的潜力,值得进一步深入研究.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2014(039)002
【总页数】5页(P93-97)
【关键词】红豆杉;内生放线菌;PCR筛查;Complestatin
【作者】罗红丽;关菲菲;沈兰;黄长武;李丹;胡昌华;廖国建
【作者单位】西南大学药学院现代生物医药研究所,重庆400715;西南大学药学院
现代生物医药研究所,重庆400715;西南大学药学院现代生物医药研究所,重庆
400715;重庆医科大学附属第二临床学院/第二医院检验科,重庆400700;西南大学
药学院现代生物医药研究所,重庆400715;西南大学药学院现代生物医药研究所,重
庆400715;西南大学药学院现代生物医药研究所,重庆400715
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.13+2
药用植物一直是新药和新药先导化合物的重要来源，如抗癌药物喜树碱，抗疟疾药物青蒿素。

分离自药用植物的化合物通常来自植物代谢，然而越来越多的证据表明，植物内生菌(endophytes)也能够产生部分植物源化合物，比如植物内生菌能够合
成抗癌药物紫杉醇和喜树碱[1]。

植物内生菌是一类生活在植物内部、正常情况下
不引起植物病症的微生物。

植物内生放线菌是一大类重要植物内生菌，能协助植物抵抗其他微生物的侵害。

此外，植物内生放线菌还能够产生多种生物活性物质，包括抗生素、抗肿瘤、抗感染物质等，是非常重要的药源微生物资源[2]。

南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K)是常绿乔木，主要分布在我国长江流域以南，产生重要的抗癌药物紫杉醇，是一种药用价值极高的药用植物[3]。

从红豆杉内生真菌中，已发现了数种能够产生紫杉醇的内生真菌[4]，这表明
红豆杉内生菌具有重要的研究价值，然而对其内生放线菌的研究并不多。

本文采集重庆北碚南方红豆杉健康植株的枝叶作为实验材料，分离内生放线菌，并检测其抗菌活性和评估次级代谢产物合成潜力，希望能为红豆杉内生放线菌资源的深入研究提供指导，为开发新的生物活性物质奠定基础。

1.1 南方红豆杉样品
3份枝叶样品采自重庆北碚的健康植株，采样时间为2010年10月。

1.2 培养基
分离培养基：腐植酸微生物琼脂(HV)、燕麦琼脂(ISP3)和自来水酵母琼脂
(TWYE)[5]。

培养基中加入制霉菌素(nystatin)25mg/L，环己亚胺(cycloheximide) 25mg/L, 萘啶酮酸(nalidixic acid)25mg/L以抑制真菌和细菌生长。

发酵培养基：GYM和SP[6]。

1.3 测试菌
耐药金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus) MRSA-1, 耐药铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)1-1，白色念珠菌(Candida albicans)2-1由重庆医
科大学提供。

试剂和仪器：PCR扩增相关试剂购自北京全式金公司，引物由上海Invitrogen公司合成，其他试剂均为国产或进口分析纯。

PCR仪和凝胶成像仪分别为BioRad Mycycler 和Gel-Doc2000。

1.4 内生放线菌的分离、纯化和保藏
按照参考文献[5]方法，对样品表面消毒。

将最后一次洗涤水涂布ISP3培养基，28℃培养，检验表面消毒效果。

采用贴片法和匀浆法，将消毒好的样品和匀浆置于分离培养基上，28℃培养2～8周。

挑取单菌落至ISP3培养基上培养纯化，将纯培养
物置于20%甘油中，-70℃保藏。

1.5 基因组DNA的提取，16S rRNA基因扩增检测和系统发育分析
按照参考文献[6]方法提取基因DNA和扩增16S rRNA基因，引物为通用保守引
物27f和1506r。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物测序由北京华
大基因公司完成。

将拼接好的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定分离菌株的分类地位，利用MEGA软件构建N-J系统
发育树。

1.6 抗菌活性测试
菌株活性采用琼脂移块法进行测试：将分离菌株琼脂块移至含有检测菌的平板上，培养24h后，观察抑菌圈。

发酵产物生物活性采用滤纸片法进行测试。

1.7 次级代谢产物生物合成基因检测
使用引物分别对分离菌株的PKSI，NRPS，卤化酶和P450酶基因进行PCR扩增。

引物序列见表1。

PCR扩增条件见参考文献[7-8]。

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶
电泳检测。

扩增产物使用PCR产物回收试剂盒纯化后，连接T载体，转化和测序。

2.1 内生放线菌的分离和抗菌活性测定
经过严格的表面消毒处理，最后一次洗涤水涂布的平板无菌落长出，表明表面消毒彻底。

可见该表面消毒程序能够保证分离得到的放线菌为植物内生而非表生或附生。

从贴片和匀浆样品的平板中共获得内生放线菌6株。

抗菌活性测试表明， 1株菌
株对耐药金黄色葡萄球菌表现出拮抗活性，1株具有抗铜绿假单胞菌活性。

所有的分离菌株对白色念珠菌均无抗菌活性(表2)。

2.2 分离菌株的多样性分析
经分离纯化得到了6株内生放线菌，对其进行16S rRNA基因PCR扩增和测序。

16S rRNA基因序列(＞1400bp)分析表明：6株分离菌株分属于链霉菌属(Streptomyces)和小单孢菌属(Micromonospora)，其中5株为链霉菌。

基于
16S rRNA基因序列构建的N-J系统发育树如图1。

由图可见， 5株链霉菌分成明显不同三簇，分别与Streptomyces lateritius， S. aurantiacus和S. charteusis 亲缘关系最近。

小单孢菌则与Micromonospora globosa亲缘关系最近。

2.3 次级代谢产物生物合成基因检测
对6株内生放线菌进行4类次级代谢产物生物合成关键基因PCR筛查，包括I型
聚酮合成酶(PKSI)，非核糖体合成酶(NRPS)，糖肽类抗生素合成关键酶P450单加氧酶基因(oxyC)和重要的天然产物修饰酶卤化酶基因(halo)。

PCR筛选结果显示，所有菌株都含有NRPS基因，2株含有PKSI基因和卤化酶基因，1株具有P450
酶基因。

有趣的是，PCR扩增发现，SWU1-005菌株所有检测都是阳性，然而在本研究中并没有表现出抗菌活性。

2.4 SWU1-005的oxyC和halo基因的生物信息学分析
为了进一步解析分离菌株的次级代谢合成潜力，SWU1-005的oxyC和haloPCR 扩增产物被克隆和测序，获得的序列与NCBI数据库中的OxyC和Halo进行序列比对。

分析发现(图2)，halo基因与糖肽抗生素万古霉素、balhimycin和complestatin生物合成簇中的halo基因有超过80%的类似性；而oxyC基因则与糖肽抗生素生物合成基因簇中的oxyC基因有超过90%的类似性，特别是与complestatin的oxyC的类似性高达95%。

序列分析表明，SWU1-005很可能具有产生新型的糖肽化合物的潜力。

遗憾的是RT-PCR分析未检测到oxyC和halo 的基因转录，这暗示本研究采用的培养基可能不适合相关基因的转录。

本研究从3株南方红豆杉的枝叶中分离得到了6株放线菌。

16S rRNA基因序列聚类分析表明红豆杉内生放线菌与分离自土壤链霉菌相似[9]，与相关的研究结果一致。

此外，生物合成基因簇的筛选也表明内生放线菌编码的基因簇(比如complestatin)也曾在土壤放线菌中被发现，这些结果都支持高等植物内生菌起源于土壤微生物的观点。

植物的内生真菌常常与植物共同进化而产生植物来源的天然产物，植物内生放线菌是否具有类似的特点，有待进一步深入研究。

此外，张曼等从陕西秦岭的红豆杉中分离得到的内生放线菌也是链霉菌和小单胞菌，暗示这两类放线菌可能是红豆杉的主要内生放线菌[10]。

天然活性化合物的分离和结构解析需要花费大量的时间和资金，往往伴随着极大的风险。

因此，次级代谢产物生物合成基因筛选作为一种快速发现新型化合物的方法以及被广泛使用，大大提高筛选效率[7-11]。

从本研究的结果来看，红豆杉内生放线菌次级代谢产物生物合成基因的检出率高达100%，说明红豆杉内生放线菌具有很好的次级代谢产物合成潜力，特别是SWU1-005号菌株极可能编码complestatin类似物的潜力。

Complestain具有多种生物活性，既是人类补体途径的抑制剂，也是HIV gp120-CD44结合的抑制剂，还能够抑制HIV-1整合酶的
活性[12-14]，complestain是一种重要的治疗HIV感染的候选药物。

本研究采集的红豆杉的数量非常有限，然而对其内生放线菌的初步分析表明，红豆杉内生放线菌具有很好的次级代谢产物合成潜力。

采用更多的次级代谢生物合成基因进行检测，如扩增PKS-II的引物将进一步揭示放线菌的合成潜力[15]。

此外，扩大红豆杉的采样范围、改进分离方法和培养条件等因素，有可能大幅度提高内生放线菌的分离数，为寻找新活性新结构化合物提供菌种。

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