1112质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

1112质粒DNA的提取、定量、酶切与
PCR鉴定
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定
一、实验流程简述实验内容流程↓ 质粒DNA提取(约1小时) ↓ 紫外检测定量知识(计算方法),步骤↓ 紫外检测定量↓ 酶切步骤↓ 酶切约1~2小时↓ 学习酶切原理，琼脂糖电泳原理↓ 电泳(样品：质粒DNA,酶切产物，Marker) ↓约30分钟观察电泳结果、记录、拍照、保存
二、实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法了解质粒酶切鉴定原理学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小
质粒DNA的提取与定量Extraction and Quantitation of Plasmid DNA
一、什么是质粒？独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；
基因工程常采用的载体
方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法概括起来主要是用非离子型或离子型去
污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离、纯化质粒DNA
二、实验原理基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

当以pH4.8的NaAc溶液调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三、实验材料宿主菌：大肠杆菌DH5a菌株载体：PMD-18T质粒插入片段基因：CHD5
CHD5
补充知识：模板基因米尔副教授领导的研究小组发现的CHD5,其编码基因位于1 号染色体的特异部分(1p36)。

当CHD5失去功能的时候，细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。

CHD5如同肿瘤抑制网络的总开关，这提示CHD5与多种人类癌症有关。

根据CHD5 的调节功能，可以设计更好更有效的癌症治疗策略。

此前，这个基因一直是个谜。

这项研究对未来的癌
症治疗将产生重要影响，提高CHD5的表达量会带来额外的抑癌效果。

临床实验中也发现，许多神经胶质瘤患者的CHD5基因缺失，说明CHD5与人类癌症有莫大关系，打开CHD5开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效。

Buffer S1(细菌悬浮液) 已加入RNaseA Buffer S2(细菌裂解液) Buffer S3(中和液) Buffer W1(洗涤液)
Buffer W2 concentrate(去盐液)已加入无水乙醇Eluent (洗脱液)
(
一)仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅(二)材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α (三)试剂：LB培养基(液体、固体) AxyPrep 质粒DNA 小量试剂盒(Axygen)
Buffer S1 50 mmol/L 葡萄糖
25 mmol/L Tris (pH8.0) Cl 10 mmol/L EDTA (pH8.0)
2 mg/mL 溶菌酶
作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活
Buffer S2 0.2 mol/ L NaOH 1% SDS
作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。

Buffer S3 5mol/L 乙酸钠60ml
冰乙酸水浓度为5mol/L。

11.5ml28.5ml
所配成的溶液中钠的浓度为3mol/L,乙酸根的作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白SDS+线性DNA沉淀，Na+可中和DNA
2、离心层析柱硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,不吸
附蛋白质、多糖等物质；通过去洗涤液和去盐液将杂质和其它细菌成分去除；
低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；
四、实验步骤1. 取1.5ml培养物加入灭菌的Eppendorf管中 2. 12,000g×1min,弃尽上清(可用枪头吸尽) 3. 加入250μl buffer S1,吹打，悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应有小的菌块。

4. 加入250μl buffer S2,温和并充分地上下翻转颠倒4~6次混匀使菌体裂解(不要剧烈振荡),直到溶液变得清亮.
5. 加入350μl buffer S3,温和并充分地上下翻转颠倒4~6次混匀.*****g×10min离心，小心取上清液(700-800μl )。

6. 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，*****g×1min离心，弃滤液。

7. 将制备管放回离心管，加入500μlbuffer W1, *****g×1min离心，弃滤液，
8. 将制备管放回离心管,加入700μl buffer W2, *****g×1min离心，弃滤液。

9. 重
复步骤8一次。

10. 空柱*****g离心1min。

11. 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加60μl-80μlEluent,室温放置1~3min,*****g离心1min洗脱质粒DNA, -20℃保存备用。

四.质粒定量检测紫外分光光度计法原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2,而且物质对光的吸收是具有选择性的3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱
一、质粒定量紫外吸收检测质粒DNA的浓度和纯度核酸的碱基(G,A,T,C)在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm 的吸收峰即可对DNA进行定量。

260nm 时，1 A=50 g /mL dsDNA =37 g /mL ssDNA =40 g /mL RNA =30 g /mL Oligo 可以通过计算确定双链DNA浓度，公式如下: dsDNA=50×(A260) × 稀释倍数以上浓度单位为g /mL (注：本实验要用的eppendorf 公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值. )
A260/A280可以
反应DNA的纯度：可根据在260nm以及在280nm的读数的比值(A260/A280) 估计核酸的纯度。

A260/A280 =1.8,纯净DNA A260/A280 1.8 ,说明样品中含有蛋白质或酚等污染。

应再用酚/ 氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA 。

A260/A280 1.8 ,说明有RNA污染，可用RNA 酶处理
二、实验仪器
三、实验方法1.打开仪器电源开关，无需预热。

2.根据样品的不同，在仪器控制面版上选择对应的方法组，如测量质粒DNA浓度选浓度选等，以此类推。

, 测量RNA
3.选择进入方法组后，选择你所需要的方法，然后按enter键
4.按parameter/dilution键按enter键确认。

(取质粒DNA样品2μl +98μl灭菌水)
确认。

设置样品稀释倍数，输入样品的体积和稀释样品所用稀释液的体积，
5.后推打开仪器上放置石英比色皿的槽盖。

6.按照设置的稀释方法，先向石英比色皿中加入对应体积的空白稀释液，然后把石英比色皿放入检测槽，按blank键8.按sample键注意事项：1.为确保液体始终处于检测区的中心位置，被检测样品的体积必须R50ul。

2.为避免石英比色皿受到污染，每次检测样品浓度前后都要用灭菌蒸馏水或去RNase水清洗石英比色皿 3.实验结束后，前推盖上检测槽的槽盖，并关掉仪器电源。

进行调零。

7.再按照设置的稀释方法，向石英比色皿中加入对应体积的样品，并用微量加样器轻轻混匀。

,仪器会根据样品的稀释倍数自动计算出样品的最终浓度。