脑卒中与一氧化氮合成酶基因相关性及预防措施的研究

脑卒中与一氧化氮合成酶基因相关性及预防措施的研究
关于脑卒中基因水平的研究近年已经受到广泛的关注，人eNOS第7外显子C894T突变使编码的第298位谷氨酸(Glu)被天冬氨酸(Asp)所取代，使eNOS发生构象改变，从而引起eNOS活性降低，NO生成减少，从而减少了对脑血流的调节和神经细胞的保护作用，促进了脑卒中的发生。

我们采用候选基因病例对照的方法，以中国汉族脑卒中的患者，与年龄、性别相匹配的无脑卒中的高血压患者和健康人为研究对象，研究eNOS基因与脑卒中的相关性，旨在寻找预防脑卒中的措施，从分子水平提示脑卒中的发病机理，及早发现脑卒中的致病基因，为脑卒中的遗传学发病基础研究及早期预警提供线索，避免脑卒中发病造成的死亡和重度致残。

资料与方法
研究对象与分组：临床共观察脑卒中病人300例，与脑卒中患者年龄性别匹配的健康人300例。

汉族，无血缘关系。

其中男190例(占63.33％)，女110例(占36.67％)，男女比例为1.60：1；病例组平均年龄为61.34，对照组的平均年龄61.03，差异无统计学意义(P=0.698)。

而腰臀比、体质指数及有无高血压、糖尿病、冠心病及吸烟史等方面，具有统计学意义。

病例排除标准：排除痴呆、癫痫、肾功能不全(血清肌酐＞132mnoL／l及≥2mg ／dl，和／或蛋白尿血尿)及肝功能不全(ALT≥正常上限的2倍，或有肝性脑病、肝硬化、食道静脉曲张或门静脉分流史)，甲状腺功能亢进或低下，慢性阻塞性肺病。

有恶性肿瘤史(包括白血病或淋巴瘤)，有自身免疫性疾病。

病人不同意参加本研究者。

研究方法：①病例组：询问高血压病史、吸烟、饮酒史。

进行CT或MIR 检查。

抽血检查血尿常规、肝、肾功能、血脂检查。

②对照组：同上。

两组抽取静脉血5～6ml进行分子生物学试验，步骤如下：从白细胞中提取DNA(采用酚-氯仿法)。

①进行DNA鉴定、定量。

②用PCR扩增eNOS基因。

③PCR扩增产物进行酶切(RFLP)。

④对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。

⑤显示电泳条带。

⑥选择不同基因型的PCR产物各3个标本DNA片段纯化吸收。

对PCR产物进行克隆。

并进行DNA测序。

观测指标：①eNOS基因型及等位基因在脑卒中组和对照组中的分布。

②eNOS基因型与脑卒中关系。

③eNOS基因型、WHR、BMI、高血压病史、吸烟、
饮酒、体育锻炼等是否具有协同效应。

统计学方法：采用X2检验和t检验比较脑卒中组与健康人组。

X2检验对基因Hardy-Weinberg平衡检验。

计算OR值。

采用Logistic多元回归分析基因多态性及其他危险因素对脑卒中的作用。

同时应用X2检验比较环境因素(吸烟)与基因之间是否存在交互作用。

所有统计学处理应用SPSS8.0软件进行处理。

结果
基因型分布：病例组：等位基因G的频率87.75％，等位基因T的频率12.25％；对照组：等位基因G的频率90.89％，等位基因T的频率9.11％。

OR值为1.570，P为0.016，T等位基因频率脑卒中组显著于对照组。

同时可见以GG基因型为参照，分析TT、GT和GT+TT基因型与脑卒中发病的关系，可见携带至少一个T等位基因的基因型个体患脑卒中的风险为携带GG基因型者的1.524倍。

以多元逐步条件logistic回归分析，调整吸烟、饮酒、体制指数、腰臀比、高血压病史等因素的影响后，eNOS Gg94T变异对脑卒中仍具有影响，OR为2.165。

讨论
脑卒中已成为人类的主要“杀手”之一。

我国脑卒中每年新发生病例约150万，其中80％是缺血性脑卒中，严重影响人民的生命和生活质量。

因此，从分子水平深入研究脑卒中的发病机制具有重要意义。

一氧化氮(NO)主要由内皮型(eNOS)调节，其在抗动脉粥样硬化及脑血流调节中起关键性作用，并最终影响梗死面积。

内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸生成NO和瓜氨酸。

内皮细胞生成的NO可促进血管平滑肌细胞舒张，抑制血管内皮表面血小板和白细胞的粘附与聚集，防止低密度脂蛋白氧化。

抑制血管平滑肌细胞增生，对血管收缩因子如内皮素及血管紧张素具有抑制作用，因此是血管AS过程重要的抑制因子。

迄今为止已有大量的研究探讨了eNOS基因多态性与冠心病、脑卒中的关系，但所得结论不一。

人eNOS含有1203个氨基酸，其基因为单拷贝，定位于染色体7q352q36，全长21-22kb，包括26个外显子和25个内含子。

第7外显子G894T突变使编码的第298位谷氨酸(Glu，等位基因G)被天门冬氨酸(Asp，等位基因T)所取代，使eNOS发生构象改变，从而引起eNO s活性降低，NO生成减少。

Elbaz等对法国12个中心460例脑卒中患者及460例年龄、性别相匹配的健康对照者研究后发现，eNO s Glu298A spT等位基因纯合子与脑梗死，尤其腔隙性梗死有关，并认为该基因遗传易感性与LDL 2eh存在协同作用。

结果表明：eNOS基因C894T变异基因型在脑卒中和对照组中分布差异有统计学意义，T等位基因频率脑卒中组显著对照组，OR为1.570。

同时单因素条件logistic回归分析显示携带至少1个T等位基因的基因型个体患脑卒中的风险为
携带GG基因型者的1.524倍。

在0.05显著性水平下，以多元逐步条件logistic 回归分析，调整吸烟、饮酒、体制指数、腰臀比、高血压病史等因素的影响后，eNOS G894T变异对脑卒中仍具有影响，OR为2.165，是脑卒中的重要的危险因素。

但脑卒中是多基因、多因素疾病，是遗传和环境因素互相作用所致。

目前已知的与其发病相关的基因大部分是单基因研究得出的结论，且国内外都存在结论不一致的报道，究其原因可能包括：①样本量、实验设计、技术和统计学的方法不尽相同；②对病例和对照的选择不同；③各研究样本的种族、地区分布不一；
④脑卒中的分类诊断标准不同。

为进一步有效筛选脑卒中的候选基因，需要更多的大样本的临床研究和开展遗传流行病学、分子流行病学研究及综合考虑多因素，对基因一基因及基因一环境相互作用进行深入研究，以便弄清脑卒中的发病机制及探索新的防治措施。