慢性膝关节炎疼痛模型的针灸治疗

慢性膝关节炎疼痛模型的针灸治疗
徐丽丽;黄娟;胥方元;万永鲜
【摘要】背景:已经证实针灸对腰背痛、膝关节痛等急性疼痛等有较好疗效,但是对于慢性疼痛的效果存在争议.目的:建立新西兰兔慢性关节炎疼痛模型,探讨针灸治疗慢性关节炎疼痛机制.方法:①32只新西兰兔使用4%木瓜蛋白酶0.3 mL注射双后肢膝关节腔内,制成兔膝骨性关节炎模型.随机分为4组,即生理盐水+电针组,生理盐水+假电针组,k-阿片受体拮抗剂(nor-Binaltorphimine,nor-BNI)+电针组,nor-BNI+假电针组,每组8只.nor-BNI用量1 mg/kg,1次/d,连续3 d;电针干预时间为实验动物给予药物后2 h,1次/d,30 min/次,直至实验动物被处死当天结束;假电针组取穴、针刺方法及时间同电针组,但不通电刺激.使用BBB评分对各组进行下肢行为学评分.给药1,3,5,7日分别处死,分离脊髓组织后多聚甲醛固定,使用免疫荧光法检测脊髓组织白细胞介素17及白细胞介素17受体A、NR1的表达水平;②另取24只新西兰兔,12只兔建立膝骨性关节炎模型后随机分为模型+生理盐水组、模型+2μg白细胞介素17抗血清组;剩余12只分为对照+生理盐水组、对照+2μg白细胞介素17抗血清组.以2μg白细胞介素17抗血清溶于10μL生理盐水中进行椎管内给药,1次/d,连续3 d.使用BBB评分对新西兰兔下肢功能进行行为测试,每次行为测试后,Western-blot测定样品中p-NR1,白细胞介素17R的表达水平.结果与结论:①nor-BNI+电针组BBB评分明显增高(P<0.05);而脊髓组织白细胞介素17及白细胞介素17受体A、NR1的表达水平明显减低(P<0.05);②使用nor-BNI拮抗阿片类受体后,nor-BNI+电针组脊髓组织NR1的表达水平与nor-BNI+假电针组相比无明显差异(P>0.05);③使用白细胞介素17抗血清处理后,模型+2μg白细胞介素17抗血清组BBB评分明显增高(P<0.05);而该组脊髓组织白细胞介素17及NR1的表达水平明显减低(P<0.05),但仍高于2个对照组(P<0.05);④实验证实,慢
性关节炎疼痛原因为白细胞介素17可以使脊髓组织NR1表达增加从而引起;电针刺激可以明显改善关节炎模型新西兰兔的下肢疼痛,这种作用是由于电针刺激减少脊髓组织白细胞介素17而非调节白细胞介素17受体A发挥作
用.%BACKGROUND:Acupuncture has been found to be effective for alleviating low back pain and acute pain due to knee arthritis, but its effect on chronic pain is under discussion. OBJECTIVE:To investigate the mechanism underlying electroacupuncture (EA) alleviating chronic pain in a New Zealand rabbit model of knee arthritis. METHODS:(1) Thirty-two New Zealand rabbits were selected, and the knee osteoarthritis model was established by injecting 4% papain into the knee articular cavity of rabbit's bilateral hind limbs. The model rabbits were randomly divided into four groups (n=8 per group): normal saline plus EA, normal saline plus sham EA, nor-Binaltorphimine (nor-BNI) plus EA, and nor-BNI plus sham EA groups. The dosage of nor-BNI was 1 mg/kg, once daily, for consecutive 3 days.
30-minute EA was given at 2 hours after administration, once daily, until the day the rabbits were killed. Sham EA indicated no given electric current. The behaviors of the lower limbs were evaluated by Basso, Beattie, Bresnahan scores. The rabbits were respectively killed at 1, 3, 5 and 7 days after administration, the spinal cord was separated, and then fixed with formaldehyde. The expression levels of interleukin-17, interleukin-17 receptor A and NR1 in the spinal cord tissues were detected by immunofluorescence. (2) The other 24 New Zealand rabbits were randomly divided into model and control groups (n=12 per group), and the knee osteoarthritis model was established in the former group. Afterwards, the
two groups were randomized into two subgroups, followed by given the intrathecal administration of normal saline, or 2 μg interleukin-17 antibody serum dissolvedin 10 μL normal sali ne, once daily, for consecutive 3 days. The behaviors of the lower limbs were evaluated by Basso, Beattie, Bresnahan scores, and the expression levels of p-NR1 and interleukin-17 receptor were detected by western blot assy. RESULTS AND CONCLUSION:The Basso, Beattie, Bresnahan scores in the nor-BNI plus EA group were significantly increased, while the expression levels of interleukin-17, interleukin-17 receptor A and NR1 in the spinal cord tissues were significantly decreased (P< 0.05). The expression level of NRI did not differ significantly between nor-BNI plus EA and nor-BNI plus sham EA groups (P> 0.05). After administration of interleukin-17 antibody serum, the Basso, Beattie, Bresnahan scores in the model group was significantly increased, and the expression levels of interleukin-17 and NR1 in the spinal cord tissues were significantly decreased, but still significantly higher than those in the control subgroups (P< 0.05). These results suggest that chronic pain in knee arthritis is the result of an increase in the expression level of NRI induced by interleukin-17. EA can remarkably improve the pain in the model rabbits of knee arthritis by downregulating interleukin-17 in the spinal cord tissues, rather than interleukin-17 receptor.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2017(021)024
【总页数】6页(P3864-3869)
【关键词】组织构建;组织工程;关节炎;疼痛;白细胞介素17;阿片受体
【作者】徐丽丽;黄娟;胥方元;万永鲜
【作者单位】西南医科大学附属医院,康复医学科,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属医院,康复医学科,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属医院,康复医学科,四川省泸州市 646000;西南医科大学附属医院,骨与关节外科,四川省泸州市646000
【正文语种】中文
【中图分类】R318
0 引言 Introduction
针灸这门中医传统治疗方法正在世界范围内逐步得到认可，目前世界卫生组织承认，有40余种疾病可适用于针灸治疗，其中疼痛是针灸的主要适应证之一[1]。

早期研究证实，针灸对腰背痛、膝关节痛等急性疼痛等有较好疗效。

在1991至2009年发表的针灸相关的共3 975篇文章中，1 647(41%)篇与针灸镇痛有关[2]。

循证医学的数据显示，针灸对手术后疼痛、急性牙痛等急性疼痛疗效确切。

Sun等[3]通
过分析1966至2007年的15篇关于针灸治疗术后疼痛的随机对照试验发现，针
灸治疗组的术后疼痛明显减轻，阿片类镇痛药的使用明显减少。

另外，临床研究发现，术前电针可降低手术中阿芬太尼的应用以及术后吗啡的应用[4]；Lin等[5]在
下腹部手术的患者中发现，电针可明显减少术后镇痛药物的应用以及相关不良反应。

相对于在急性疼痛治疗中的明确数据支持，在慢性疼痛的治疗中，针灸的作用却存在较大的争议。

研究采用木瓜蛋白酶新西兰兔膝关节腔内注射法模拟膝关节炎慢性疼痛模型并进行研究。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计动物实验研究。

1.2 时间及地点 2015年3月至2016年6月在西南医科大学附属医院动物实验中心完成。

1.3 材料
1.3.1 试剂和仪器 nor-Binaltorphimine (nor-BNI)(sigma公司美国)；木瓜蛋白
酶(sigma公司美国)；药敏纸片(Oxoid)；Taq Master Mix(SinoBio)；琼脂糖(Biowest)；白细胞介素17(IL-17)，白细胞介素17受体A(IL-17RA)，NR1抗体，p-NR1抗体(1∶500；Biolegend，美国)；β-actin抗体(1∶5 000；Invitrogen，美国)，戊巴比妥钠(广州化学制品厂)；Trizol(Invitrogen，美国)；PCR扩增仪(Eppendorf)；凝胶成像仪(Syngene)；电泳仪(北京市六一仪器厂)；离心机(Eppendorf)；海尔制冰机，Western Blot电泳仪(Rad-Bio)；-80 ℃冰箱(Thermo)；NanoDrop2000光度仪(Thermo，美国)；水浴锅(北京医疗器械厂)；病理切片机(leica，德国)；韩式电针仪(HANS-200A，南京济生医疗科技有限公司，中国)；针灸针(40号，0.16 mm×7 mm，AcuBEST，美国)。

1.3.2 实验动物新西兰兔56只，雌雄不限，造模前检测并记录每只兔体质量、BBB评分，周龄等基线数据。

所有实验动物均由西南医科大学动物实验中心提供。

1.4 实验方法选择周龄体质量等基线数据相似的新西兰兔56只分为2个实验，分别研究强效高选择性k-阿片受体拮抗剂(nor-Binaltorphimine，nor-BNI)及白细
胞介素17在慢性膝关节炎新西兰兔模型中的作用。

1.4.1 干预措施电针组用棉签蘸取体积分数75%乙醇消毒双侧“足三里”及“内
外侧膝眼”，实验动物取穴方法参照《实验针灸学》[6]。

将针灸针刺入，进针深
度约5 mm，2个针柄分别连接韩氏电针仪的2个电级(2 Hz/100 Hz，30 min)，刺激刚开始电流强度为1 mA，5 min后调至1.5 mA。

干预时间为实验动物给予
药物后2 h，1次/d，30 min/次，直至实验动物被处死当天结束。

假电针组取穴、针刺方法及时间同电针组，但不通电刺激。

1.4.2 实验1 随机选择32只新西兰兔，造模前检测并记录每只兔体质量、BBB评
分[7]、周龄等基线数据。

参考文献使用4%木瓜蛋白酶0.3 mL注射32只新西兰
兔双后肢膝关节腔内，2 d注射1次，连续注射3次，建立兔慢性膝骨性关节炎模型[8]，实验动物造模成功后随机分为4组，即生理盐水+电针组，生理盐水+假电针组，nor-BNI+电针组，nor-BNI +假电针组，每组8只。

4组给药方法均为椎
管内给药，首次给药时间是在造模成功后第1天，1次/d，连续3 d，nor-BNI用量1 mg/kg，生理盐水用量1 mg/kg。

4组实验动物给药后1，3，5，7 d分别
分批处死，处死前进行BBB评分。

处死后分别分离各自脊髓组织采用多聚甲醛固定，使用免疫荧光法及Western-blot方法检测脊髓组织白细胞介素17及白细胞
介素17受体A、NR1的表达水平。

1.4.3 实验2 剩余新西兰兔24只，使用4%木瓜蛋白酶(方法同前)对其中12只建
立兔膝骨性关节炎模型后随机分为2组，即模型+生理盐水组、模型+2 μg白细胞介素17抗血清组。

其余12只兔不造模作为对照，分为对照+生理盐水组、对照
+2 μg白细胞介素17 抗血清组。

2 μg白细胞介素17抗血清溶于10 μL生理盐
水中进行椎管内给药，每只动物每日给药1次，连续3 d。

模型+生理盐水组只采用10 μL生理盐水进行椎管内给药，给药时间分别为造模前24 h；对照组在同样
时间点采用同样方法进行椎管内给药。

给药后2 h使用BBB评分对新西兰兔下肢
功能进行行为测试。

给药后1 d使用Western-blot测定样品中 p-NR1，白细胞
介素17受体A及NR1的表达水平。

1.4.4 Western Blot法检测p-NR1、白细胞介素17受体A及NR1表达水平前
期取部分新西兰兔脊髓组织，并在液氮中进行研磨后，使用丙酮初步提纯。

放在冰裂解缓冲液中，蛋白质浓度测定用Bio-Rad蛋白试剂盒(Bio-Rad，美国)。

样品
(50 μg)分离使用10% sds-page，加入聚偏二氟乙烯膜中。

膜使用一抗孵化过夜。

免疫反应性检测，一抗过夜后，使用二抗和可视化增强化学发光法进行检测。

一抗使用anti-NR1，anti-白细胞介素17受体A及anti-NR1(1∶500；Biolegend，美国)，抗p-NR1，抗p-白细胞介素17受体A及抗-p-NR1 (1∶1 000；cell signaling，美国)，和anti-β-actin(1∶5 000；Invitrogen，美国)。

条带信号定
量使用ImagePro+6.0成像软件进行定量分析。

1.4.5 BBB运动功能评分 BBB运动评分是评价大鼠脊髓损伤后运动功能的评分系统，其最低为1分，最高为21分，得分越高，表明下肢运动功能越好。

1.5 主要观察指标①膝关节炎新西兰兔下肢BBB评分；②脊髓组织白细胞介素17，白细胞介素17受体A ，NR1表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0进行统计学处理分析，两组间比较采用t 检验；
分析定性数据采用方差分析检验和χ2检验，不满足条件者的四格表数据采用Fisher精确概率法；定量数据比较使用方差分析进行检验；P < 0.05认为差异有
显著性意义。

2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析实验选用新西兰兔56只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 造模前入组新西兰兔基线数据比较入组新西兰兔造模前的基线数据进行比较
发现，各组数据无明显统计学差异(P > 0.05)。

见表1。

表1 造模前入组新西兰兔基线数据比较(±s)Table 1 Comparison of the baseline data of the New Zealand rabbits between two groups组别 n 体质量(kg) 周龄造模前BBB评分造模组44 3.3±2.1 12.8±1.2 20.5±0.4对照组 12 3.2±1.9 12.2±1.4 20.3±0.3 t 0.33 0.43 0.42 P 0.42 0.32 0.71
表2 膝关节炎新西兰兔下肢BBB运动评分比较(±s)Table 2 Comparison of the
Basso, Beattie, Bresnahan scores of the lower limbs in the new Zealand rabbits with knee arthritis组别造模前造模后干预后1 d 干预后3 d 干预后5
d 干预后7 d F P生理盐水+电针20.19±0.21 2.37±0.27 7.81±1.20
10.33±2.10 12.31±2.62 15.52±0.4 22.48 < 0.001生理盐水+假电针
20.33±0.11 3.28±1.29 3.21±1.40 3.63±0.92 3.82±1.23 4.03±1.3 0.43 0.38 nor-BNI+电针20.12±0.21 3.24±1.09 9.30±0.78 12.43±2.30 15.72±2.32
18.3±0.91 32.39 < 0.001 nor-BNI+假电针20.09±0.32 2.36±0.14 5.27±0.81 7.27±1.30 9.24±3.24 9.81±0.87 22.38 < 0.001 F 0.33 0.29 12.73 21.45 22.58 32.98 P 0.62 0.32 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001
2.3 实验1结果
2.3.1 各组BBB评分研究发现，nor-BNI +电针组BBB评分明显增高(P < 0.05)，见表2，图1。

2.3.2 脊髓组织白细胞介素17及白细胞介素17受体A、NR1的表达各组处理后
7 d免疫荧光及Western blot检测结果表明，nor-BNI +电针组脊髓组织白细胞
介素17及白细胞介素17受体A、NR1的表达水平明显减低(P < 0.05)；使用
nor-BNI拮抗阿片类受体后，nor-BNI+电针组脊髓组织NR1的表达水平与nor-BNI +假电针组相比无明显差异(P >0.05)。

但白细胞介素17及白细胞介素17受
体A水平明显减低(P < 0.05)，见图2，3。

上述结果提示，电针刺激改善关节炎新西兰兔下肢BBB评分是通过减少脊髓组织
白细胞介素17及NR1表达发挥作用。

2.4 实验2结果为了进一步研究电针刺激的作用，使用白细胞介素17抗血清进行处理，结果发现，模型+2 μg白细胞介素17抗血清组BBB评分明显增高(P <
0.05，图4)，脊髓组织白细胞介素17及NR1的表达水平明显减低(P < 0.05)，
但仍高于对照+生理盐水组及对照+白细胞介素17抗血清组(P < 0.05)，而白细胞
介素17受体A水平无明显变化(P >0.05)，见图5。

3 讨论 Discussion
目前针灸在治疗慢性疼痛中的有效性还尚存争议[9-11]，但多数研究报道针灸在慢性疼痛的治疗中是有效的[12-17]，2004年，Berman等[9]组织的严格的随机、
双盲、大型临床对照试验发现，与假针对照和单纯教育组相比，电针对膝关节炎患者的疼痛症状和关节功能评分具有积极的影响。

因为该试验样本量大(570个样本)、控制严格(随机、双盲、假针对照)、随访时间长(26周)，为针灸在膝关节炎中的疗效提供了较为可信的证据。

另外，2008年的一个随机对照试验同样支持针灸对膝关节炎有效的结论。

Jubb等[10]研究发现，手针和电针均可改善膝关节炎患者的
疼痛症状，而假针对照则无法达到镇痛效果。

在对肩关节炎的治疗上，针灸的作用同样得到证实，2010年，在德国一个由424例参与的随机对照试验中[11]，与假针对照和传统治疗相比，针灸组起到更好的镇痛疗效并且可显著改善患者的肩关节功能。

这种治疗作用在疗程结束后3个月依然存在。

2011年，疼痛界的权威杂志《Pain》上一篇关于针灸的综述更是从循证医学的高度指出，针灸对疼痛无效且
有很多副作用，建议临床工作者不要使用针灸镇痛[18]。

但是这篇文章很快遭到针灸以及疼痛研究者的反对和统计学界的质疑；德国神经生理学家 Christian认为，相对于其他镇痛药物来说，针灸的应用是安全的，并且在一定程度上是有效的[19]。

因此，通过基础实验寻找针灸镇痛的物质基础显得至为关键。

在本研究中发现，nor-BNI+电针组BBB评分明显增高(P < 0.05)，而脊髓组织白细胞介素17及白
细胞介素17受体A、NR1的表达水平明显减低(P < 0.05)。

使用nor-BNI拮抗阿片类受体后，nor-BNI+电针组脊髓组织NR1的表达水平与nor-BNI+假电针组相比无明显差异(P > 0.05)。

但白细胞介素17及白细胞介素17受体A水平明显减
低(P <0.05)，这与目前的研究结果基本一致。

目前比较明确的是，阿片类受体是
针灸镇痛的主要靶点之一，μ和δ阿片类受体参与介导电针(EA)治疗完全弗氏佐剂
(CFA)和辣椒素诱导的炎性疼痛以及大鼠尾干受伤引起的神经痛，因此，电针亦有可能通过阿片类受体治疗慢性关节炎性疼痛。

另一方面，研究数据证实，针灸可有效治疗急性炎性疼痛，脊髓腰膨大胶质细胞分泌的细胞因子可能是其起效靶点之一，并且脊髓腰膨大星状胶质细胞和小胶质细胞的活化被认为与炎性疼痛密切相关。

为了证明电针刺激引起关节炎症减退是通过白细胞介素17而非白细胞介素17受
体A发挥作用的，作者设计使用白细胞介素17特异性的抗血清。

进而发现，使用白细胞介素17抗血清处理后，模型+2 μg白细胞介素17抗血清组BBB评分明显增高(P < 0.05)，而该组脊髓组织白细胞介素17及NR1的表达水平明显减低(P < 0.05)，但仍高于对照+生理盐水组及对照+白细胞介素17抗血清组(P < 0.05)。

而白细胞介素17受体A水平无明显变化(P > 0.05)。

这就从根本上排除了由于脊
髓组织白细胞介素17受体表达水平变化引起的改变。

图1 电针刺激处理前后新西兰兔双下肢BBB评分Figure 1 The Basso, Beattie, Bresnahan scores of the lower limbs of the new Zealand rabbits before and after electroacupuncture图注：与造模后即刻比较，aP ≤ 0.001。

图2 免疫荧光染色检测电针刺激后兔脊髓组织白细胞介素17、白细胞介素17受
体A及NR1表达Figure 2 Expression levels of interleukin-17, interleukin-17 receptor A and NR1 in the rabbit spinal cord tissues after electroacupuncture (immunofluorescence, x400)图注：图A(×400)蓝色荧光
为BDNF显示细胞核，白细胞介素17，白细胞介素17受体A ，NR1为红色荧光；B显示nor-BNI+电针组荧光面积明显小于其他各组(P < 0.05)。

图3 Western blot检测电针刺激后兔脊髓组织白细胞介素17，白细胞介素17受体A ，NR1表达Figure 3 Expression levels of interleukin-17, interleukin-17 receptor A and NR1 in the rabbit spinal cord tissues after electroacupuncture detected by western blot assay图注：nor-BNI+电针组
白细胞介素17，NR1及白细胞介素17受体A水平明显低于其他组(P < 0.05)。

图4 白细胞介素17处理后各组兔下肢BBB评分Figure 4 The Basso, Beattie, Bresnahan scores of the rabbit lower limbs in each group after administration of interleukin-17 antibody serum图注：给药后1d，模型+2
μg白细胞介素17抗血清BBB评分明显高于模型+生理盐水组(P < 0.05)。

图5 白细胞介素17处理后1 d兔脊髓组织白细胞介素17，白细胞介素17受体
A ，NR1表达Figure 5 Expression levels of interleukin-17, interleukin-17 receptor A and NR1 in the rabbit spinal cord tissues at 1 day after administration of interleukin-17 antibody serum图注：模型+2 μg白细胞介
素17抗血清组白细胞介素17及NR1的表达水平明显减低(P < 0.05)；白细胞介
素17受体A水平无明显变化(P > 0.05)。

在早期实验中，膝关节注射甲基化的牛血清蛋白可导致局部白细胞介素17浓度的明显上升，同时施予甲基化的牛血清蛋白和白细胞介素17抗血清则可明显提高大鼠的机械缩足阈值[20]。

单纯膝关节注射白细胞介素17可明显降低机械缩足阈值
[20]。

同样，足底注射白细胞介素17可引起小鼠机械痛觉过敏和热痛觉过敏[20-
21]。

白细胞介素17的表达水平在受伤的坐骨神经中同样会升高，并且坐骨神经
内注射白细胞介素17 可同时诱发机械痛觉过敏和热痛觉过敏[22]。

这些数据说明，外周白细胞介素17在炎性疼痛和神经痛中均起着一定的作用[23-24]。

有研究发现，脊髓腰膨大胶质细胞分泌的白细胞介素1β等细胞因子参与介导针灸镇痛。

以此类推，如果脊髓白细胞介素17 参与介导炎性疼痛，那么，这种细胞因子也可能介导针灸镇痛。

而在本实验中，作者还存在一定的局限性，主要检测了白细胞介素17在脊髓中的表达水平而对于血清及模型组新西兰兔脑组织中白细胞介素17等
并未检测。

因此，研究结论还需要研究加以证实，从而为针灸治疗慢性疼痛提供理论支持。

本次研究证实，电针刺激可以明显改善关节炎模型新西兰兔的下肢疼痛，这种作用是由于电针刺激减少脊髓组织白细胞介素17而非调节白细胞介素17受体A发挥作用，可以作为治疗慢性关节疼痛的治疗方法之一。

作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者，实施为全体作者，第一作者成文，通讯作者评估。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

实验动物在戊巴比妥钠麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

文章的撰写与编辑修改后文章遵守了《动物实验体内实验研究报告规范指南》(ARRIVE指南)。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。

作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。

论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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