全血中DNA的5种不同提取方法比较研究

动物医学进展,2006,27(6):96299
Progress in Veterinary Medicine
全血中DNA的5种不同提取方法比较研究3
黄大鹏,陈建华
(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319)
中图分类号:Q523文献标识码:A文章编号:100725038(2006)0620096204
摘　要:比较几种从血液中提取DNA方法所需要的时间、样本量、提取的DNA纯度、产量以及成本等。

结果表明,几种方法所提取的DNA质量都能达到分子生物学的试验要求,但在DNA的纯度、产量、试验时间和价格等方面存在差别。

实验人员可根据自己的实验要求、实验室以及经济条件等选择适当的方法。

关键词:基因组DNA;聚合酶链式反应;提取自20世纪50年代Wat son J D和Crick F提出DNA双螺旋模型以来,分子生物学在广度和深度上都获得了空前的发展。

现在分子生物学技术已经渗透到生物学、医学、遗传学和动物学等各个方面。

从全血中提取DNA是分子生物学研究的第一步,也是非常关键的一步,DNA提取的质量和产量直接影响了PCR扩增,限制性内切酶的酶切反应以及分子克隆等试验的成败。

提取DNA的方法很多,当今科学技术的飞速发展使很多方法及试剂商品化,大大缩短了提取DNA的时间,但是相应的使价格成倍的增长。

因此,从具体的实验要求,样本的大小、实验室的条件和经济等方面考虑,寻找简便、成本较低的方法很有必要。

本文比较了几种全血提取DNA方法,并作了详细的分析,供实验人员参考。

1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　血样采集　随机选取18头三江白猪,前腔静脉采血,每5mL全血加入1mL ACD抗凝剂,混匀编号后,放入-20℃冰箱中保存。

ACD抗凝剂为每100mL灭菌双蒸水中含柠檬酸0.51g,柠檬酸钠1.35g,葡萄糖1.46g,高压灭菌备用。

1.1.2　实验仪器　北京六一仪器厂生产的紫外分光光度计,美国Hartland W I公司生产的6022502CE紫外凝胶成像分析系统,美国GeneAmp公司生产的N8050200PCR扩增仪。

1.2　方法
1.2.1　DNA的快速提取　参照文献[1]进行。

1.2.2　PBS2酚/氯仿抽提法　参照文献[1]略加改进进行。

1.2.3　T T(Trion X2100和　Tris2HCl等混合液总称)溶血法参照文献[2]进行。

1.2.4　传统DNA提取方法　参照文献[2]进行。

1.2.5　试剂盒方法提取DNA　DNA提取试剂盒由大连宝生物公司合成,实验方法参照文献[3]进行。

1.3　基因组DNA的检测
1.3.1　DNA提取的耗时分析　DNA提取的时间不包括配置常用溶液的时间,只包括从处理后的抗凝血中提取DNA到电泳鉴定所需要的时间(包括配置现用现配的溶液所需要的时间,蛋白酶K消化的时间和操作所利用的时间)。

1.3.2　紫外分光光度仪检测　取5μL DNA样品加水稀释至1mL,混匀,转移至比色杯中;1mL水做空白对照校零,应用紫外分光光度计测定DNA 样本的OD260、OD280吸光度值,计算DNA样本的纯度。

纯度测定公式:DNA纯度=A260nm/A280nm。

A280nm为280nm的波长处光吸收读数,根据OD260的值把DNA稀释至20ng～30ng之间用于PCR 扩增。

DNA产量的计算:对于双链DNA来说,OD值为1.0所对应的DNA浓度为50μg/mL,因此DNA 的浓度约为样品在260nm处OD值的10倍。

由于实验中每种方法所用的血液量不同,根据所用的血液量,按照一定的比例加TE来溶解DNA。

1.3.3　琼脂糖凝胶电泳检测　估算样品中DNA 含量的一种快速方法是利用嵌入DNA中的溴化乙
3收稿日期:2006201212
作者简介:黄大鹏(1968-),男,湖南邵阳人,副教授,主要从事猪的营养与饲料加工研究。

锭分子受紫外光激发而发射的荧光。

由于这种荧光的强度与DNA 总质量数成正比,通过比较样品与一系列标准品的荧光强度,可对样品中的DNA 进行定量。

取3μL DNA 上样,用10g/L 琼脂糖电泳检测,凝胶含EB 替代物,100V ,电泳1h 。

紫外灯下观察电泳结果,与DNA Marker 比较DNA 的亮度、整齐度和位置,以大体估计DNA 的浓度和纯度[4]。

2　结果
2.1　紫外分光光度计检测结果
5种方法提取DNA 的纯度、产量与价格及血液
需要量(表1)。

PBS 法和TT 溶血法提取的DNA 的OD 260/OD 280比值和含量分别为1.88,281.82μg/mL
和23.80μg/mL ,都优于DNA 快速提取方法和传统提取方法。

PBS 法所提取的DNA 含量最多,缺点是试验的时间较长。

传统的DNA 提取方法,所提取的DNA 纯度和含量均不高,且含有RNA 等杂质多,对PCR 效果有一定的影响,但经过多次提取或纯化后能够满足试验的要求。

快速提取DNA 的方法,虽然操作时间短,但所提取的DNA 的纯度和传统的提取方法相似,且提取的DNA 总量少。

传统提取方法应用的血量最多。

以上4种方法所应用的试剂皆为实验室的常规品,价格相对低廉,每个样本都不超过1元,而应用试剂盒方法提取DNA ,虽然纯度和产量都很高,但价格很高,每个样本的成本达到5.3元。

表1　5种方法提取DNA 的纯度、产量与价格及血液需要量
Table 1　The purity ,yield ,cost and blood volume of ext ractd DNA by 5kinds of met hods
方法
Met hod
样本
Sample 每个样本耗时/h
Time per sample
纯度
Purity DNA 产量/(μg ・mL -1)DNA yield
每个样本价格/元
Cost per sample 血液量/μL
Blood volume
快速提取方法
Rapid met hod 18
5
1.75
18.4
0.45
600
PBS 酚2氯仿抽提法
PBS 2hydroxybenzene/chloroforn met hod 1816 1.88280.75500
T T 溶血法
T T hemolytic met hod
183 1.8223.800.80500传统提取方法
Tradational met hod
188 1.7019.60.63000试剂盒提取法
K it met hod
18
1
2.0
40
5.3
100
2.2　含溴化乙锭的10g/L 琼脂糖凝胶电泳检测及结果分析
1～4.DNA 产物;M.DNA 标准DL 15000 1～2.DNA 产物;M.DNA 标准DL 15000 124.DNA product s ;M.DNA Maker DL 15000 122.DNA product s ;M.DNA Maker DL 15000
图1　用快速提取法提取的DNA 图2　PBS 2酚/氯仿抽提法提取的DNA
Fig.1　Extracted DNA by rapid DAN extraction met hod Fig.2　Extracted DNA by PBS 2hydroxybenzene/chloroform extraction met hod
7
9黄大鹏等:全血中DNA 的5种不同提取方法比较研究
1～3.DNA产物;M.DNA标准DL15000 1～3.DNA产物;M.DNA标准DL15000
123.DNA product s;M.DNA Maker DL15000 123.DNA product s;M.DNA Maker DL15000 图3　T T溶血法提取DNA 图4　传统DNA提取方法
Fig.3　Extracted DNA by T T hemolytic met hod Fig.4　Extracted DNA by t raditional met
hod
1～4.DNA产物;M.DNA标准DL15000
124.DNA product s;M.DNA Maker DL15000
图5　试剂盒法提取DNA
Fig.5　Extracted DNA by kit met hod
电泳后在凝胶成相仪上照相,如果电泳后出现弱带或主带之外存在杂带,说明DNA可能有降解现象,如果电泳后出现一条强带,则说明提取的DNA 质量较高[5]。

从图1中可以看出,快速提取DNA的方法所提取的DNA条带较弱,DNA的质量不如PBS2酚2氯仿抽提法及T T溶血法提取DNA和试剂盒法提取的DNA。

传统的提取方法提取的DNA,在主带下方看到亮区有脱尾现象即所提取的DNA 有降解现象,说明提取的DNA短片段多且不纯。

PBS2酚/氯仿法和T T溶血法提取DNA的主带亮度仅次于利用试剂提取的DNA条带的亮度,但条带较宽,说明所提取的DNA的纯度不如试剂盒所提取的DNA的纯度高。

3　讨论
通过紫外光分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳分析结果可知,由于PCR具有高度的特异性和敏感度,待测样品中的DNA只需简单加热裂解处理甚至不需要任何处理,便可达到用PCR的程度,但不能混有蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA发生结合的蛋白。

在大多数情况下,人们都希望获得较高纯度的DNA。

因此,提取DNA不仅要保证其一级结果的完整性,排除其他生物大分子(蛋白质、多糖、脂类等)的污染,以及核酸分子之间的污染,而且不应存在过高浓度的有机溶剂和金属离子,以避免化学因素对核酸中的磷脂二酯键的破坏和对后续的酶反应产生抑制作用[627]。

我们提取DNA所选用的方法,应该根据实验室的设备条件和对试验时间要求的紧迫性出发,在保证提取DNA 质量的条件下,尽量使用实验室的常规药品配置溶液,这样能做到成本低廉,然后再选择相对省时简便的方法。

参考文献:
[1]　Sambrook J,Frit sh E F,Mantitatis T.分子克隆实验指南(第3
版)[M].北京:科学出版社,2002:4632471.
[2]　萨姆布鲁克J,弗里奇E F.分子克隆实验指南(第2版)[M].
北京:科学出版社,1995.
[3]　蔡文琴,毛裕民,谢　毅.现代化实用细胞与分子生物学实验技
术[M].北京:科学出版社,1998:30271.
[4]　闾宏伟,胡　靖,袁　洪,等.四种微量全血DNA提取方法的比
较[J].中国医学工程,2004,(10):43245.
[5]　霍金龙,罗古月,张　娟,等.从猪血中提取高质量基因组DNA
的研究[J].上海畜牧兽医通讯,2004,(3):23225.
[6]　刘哓岩.猪H2FABP基因多态性及其与肌内脂肪含量的遗传相
关性研究[D].四川雅安:四川农业大学,2004.
[7]　胡盛平,朴英姬,陈　玲,等.三种全血提取基因组DNA方法的
比较及Genomix方法的改良[J].汕头大学医学院学报,2001, 14(4):2632265.
89动物医学进展　2006年　第27卷　第6期(总第152期)
动物医学进展,2006,27(6):992102
Progress in Veterinary Medicine
栝楼根提取物抗肿瘤作用初探
吴红军1,2,吴国娟13,沈　红1,稻富秀夫3,长泽弘3
(1.北京农学院动物科学技术系,北京102206;2.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐830052;
3.日本东京明治大学农学院,日本东京)
中图分类号:S857.4;S853.74文献标识码:A文章编号:100725038(2006)0620099204
摘　要:为探究栝楼根提取物的药理作用,通过体外细胞毒性试验和动物试验观察栝楼根提取物对肿瘤的影响。

细胞毒性试验表明栝楼根提取物在0.5mg/mL以上浓度时明显抑制小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)的生长;动物试验表明栝楼根提取物在0.1mg/mL注射剂量时肿瘤抑制效果最佳,抑制率可达40.9%。

关键词:栝楼根提取物;抗肿瘤;有效成分栝楼为葫芦科多年生草质藤本植物,全国大部分地区均有分布,是我国传统常用中药材,其籽、子、根及全栝楼均可单独药用。

现代医学研究表明,栝楼具有降低血清胆固醇、减少微循环障碍的发生等作用[1]。

栝楼根又名天花粉,其成分复杂,主要含有三萜皂苷、糖、色素、脂肪、有机酸、盐类、树脂等,叶含山奈苷,其提取液具有抗癌作用,能杀死体内腹水型癌细胞[2]。

传统中医认为栝楼根具有清肺化痰,养胃生津的作用。

早在20世纪70年代,栝楼根就被用于恶性滋养叶肿瘤的治疗,且为首选药物。

随着人们对栝楼根研究的深入,已经应用于各种肿瘤的治疗[3]。

研究发现栝楼根对绒毛膜上皮瘤有独特的疗效,可以选择性的损坏绒毛膜上皮癌细胞和黑色素瘤细胞[4]。

本试验初步研究栝楼根提取物对肿瘤的作用,为抗肿瘤新药的开发提供试验依据。

1　材料与方法
1.1　实验动物
Balb/c小鼠,购于军事医学科学院实验动物中心。

1.2　骨髓瘤细胞
小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),由北京大学生命科学院惠赠。

1.3　药品
栝楼根提取物由日本明治大学农学院稻富秀夫教授惠赠。

DM EM培养基(Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青公司),四唑盐(M T T)(北京欣经科公司),二甲基亚砜(北京欣经科公司)。

收稿日期:2006202224
作者简介:吴红军(1979-),男(满族),吉林吉林人,硕士,主要从事药物残留检测的研究。

3通讯作者
[8]　Radodonirina M,Cotte L,Boilieux A,et al.Detection of pneu2
mocystis carinii DNA in blood specimens from human immuno2deficiency virus2infected patient s by nested PCR[J].J Clin Mi2 crobiol,1999,37(1):127.
Comparing Five Kinds of Methods to Extact G enomic D NA from Whole Blood
HUAN G Da2peng,CH EN Jian2hua
(College of A ni mal S cience and Technolog y,Heilongj iang A u gust Fi rst A g ricult ure Universit y,Daqing,Heilongj i ang,163319,China) Abstract:Comparison of5kinds of met hods for genomic DNA ext raction by analyzing t heir time2costing, blood quantity,ext racted DNA p urity and cost.The result s showed t hat5kinds of met hods all could p ro2 vide high quality of DNA,but t hey were different in terms of t he DNA yield,DNA p urity,t he time and la2 bor inp ut,and t he cost.We should choose a relatively ideal met hod for genomic DNA ext raction f rom whole blood considering experiment,laboratory apparat us and economic condition.
K ey w ords:genomic DNA;PCR;ext raction。