酸驼乳中益生乳酸菌的分离筛选

酸驼乳中益生乳酸菌的分离筛选
张七斤;吕天星;于晨龙;陈光明;苏日娜;李智
【摘要】旨在评价酸驼乳中乳酸菌的益生特性.采用常规方法从内蒙古阿拉善牧区采集的酸驼乳中分离乳酸菌;利用16S rDNA PCR及序列分析法对分离到的乳酸菌进行种水平鉴定;通过体外抑菌试验和耐酸、耐胆盐试验评价乳酸菌的益生特性.结果表明,从酸驼乳中分离到的1株疑似乳酸菌被鉴定为短乳杆菌,将其命名为Lactobacillus breris LT;该菌株的代谢产物对4种常见肠道性致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌)均表现出良好的抑菌特性,且抑菌特性不受胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响;该菌株能够在低pH值(2.0、3.0)和高胆盐含量(0.1％～0.3％)的MRS培养基上生长.该研究结果为酸驼乳中优质乳酸菌资源的开发利用提供了科学依据.
【期刊名称】《畜牧与饲料科学》
【年(卷),期】2017(038)008
【总页数】5页(P1-5)
【关键词】乳酸菌;鉴定;益生特性;体外抑菌;耐酸;耐胆盐
【作者】张七斤;吕天星;于晨龙;陈光明;苏日娜;李智
【作者单位】内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特 010018
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
乳酸菌是一群能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌总称。

乳酸菌广泛存在于食品、饲料，以及土壤、植物根际、湖泊、河水等。

乳酸菌在胃肠道中繁衍增殖，能维持肠道菌群平衡、增强机体免疫功能，同时具有抗致病菌感染、抗肿瘤和预防衰老等作用［1-2］。

因此，乳酸菌的分离筛选及其益生特性的研究对乳酸菌相关产品的研究开发非常重要。

笔者利用分子生物学技术对分离自内蒙古阿拉善牧区驼酸乳中的乳酸菌进行种水平鉴定，在此基础上，采用经典方法进一步评价其主要益生特性，以期为酸驼乳中优质乳酸菌资源的开发利用提供科学依据。

1.1 试验材料
1.1.1 酸驼乳：采集自内蒙古阿拉善牧区。

1.1.2 主要试剂：MRS肉汤培养基、营养琼脂、LB肉汤、脑心浸出液、牛胆盐购
自广东环凯微生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶购自GIBCO公司；盐酸、乳酸购自天津市永大化学试剂有限公司。

DNA提取试剂盒（Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit）、PCR反应试剂、琼脂糖购自宝生物
工程（大连）有限公司。

1.1.3 指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）K88、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26001、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）S50333、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）C53-3由内蒙古农业大学兽医学院微生物学课程组提供。

1.2 试验方法
1.2.1 乳酸菌的分离：将采集的酸驼乳样品直接在MRS固体培养基上划线接种，37℃厌氧培养24 h；选择可疑菌落接种于MRS固体培养基，37℃培养48 h；再
次划线MRS固体培养基，37℃厌氧培养24 h。

确认菌落为纯培养物后将其冻存，备用。

1.2.2 乳酸菌的分子生物学鉴定
1.2.2.1 引物的设计：利用不同种属、种间乳酸菌16S rDNA序列两端比较分析设计引物。

引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.2.2 乳酸菌DNA的提取：将乳酸菌接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24 h，活化3代，按照DNA提取试剂盒说明书提取乳酸菌DNA。

1.2.2.3 PCR扩增：以提取的乳酸菌DNA为模板进行 PCR 扩增。

PCR 反应体系（50 μL）如下：10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，DNA 模板2.5 μL，上
游引物和下游引物各2.5 μL，Ex Taq 0.5 μL，ddH2O 33 μL。

PCR反应程
序如下：94℃预变性3 min；94℃变性 45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，35个循环；72℃终延伸10 min；4℃保温。

1.2.2.4 DNA测序及分析：PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送往北京六
合华大基因科技股份有限公司进行测序。

将测序得到的结果与GenBank上公布的细菌16S rDNA采用BLAST方法进行比较，再运用DNAStar程序中的Clustal V 方法进行相关种属及系统进化树分析。

1.2.3 乳酸菌体外抑菌试验
1.2.3.1 菌液的制备：将乳酸菌接种在MRS液体培养基中，37℃培养36～48 h，传代培养3次后进行抑菌试验及耐酸、耐胆盐试验。

1.2.3.2 代谢产物的制备：将传代培养3代后的乳酸菌4 000 r/min离心15 min，取上清液，经细菌过滤器过滤，收集滤液即为乳酸菌代谢产物。

1.2.3.3 代谢产物的处理：用乳酸菌的代谢产物原液进行抑菌试验；将乳酸菌的代
谢产物用0.5 mg/mL胰蛋白酶和1 mg/mL胃蛋白酶进行处理，然后开展抑菌试验。

1.2.3.4 抑菌圈的测定：采用牛津杯法。

将指示菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠
伤寒沙门菌、单增李斯特菌活化后，接种于LB培养基中培养24 h，用灭菌吸管分别吸取各菌液培养物0.3 mL于脑心浸出液固体培养基中，用涂布器均匀涂布，待培养基表面水分干燥后，在平板表面放置灭菌的牛津杯；取制备的乳酸菌上清液加入牛津杯内，37℃培养10 h，测定其对指示菌的抑菌活性，观察并测定抑菌圈的
大小。

1.2.4 耐性试验
1.2.4.1 耐酸性试验：将活化好的乳酸菌分别接种在pH值为1.0、2.0、3.0的MRS培养基上，以不调pH值的MRS培养基做对照。

1.2.4.2 耐胆盐试验：将活化好的乳酸菌接种在分别含有0.1%、0.2%、0.3%牛胆
盐的MRS培养基上，并以不含牛胆盐的MRS培养基做对照。

2.1 乳酸菌的分离从阿拉善牧区采集的酸驼乳中分离得到1株疑似乳酸菌，菌株
在MRS固体培养基呈表面光滑、灰白色、扁平、边缘不整齐、易于刮起的直径约
1 mm的菌落；革兰染色呈阳性，镜检可见两端钝圆的短杆菌，未见鞭毛、荚膜。

2.2 16S rDNA PCR扩增以提取的乳酸菌DNA为模板进行细菌16S rDNA PCR
扩增，将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果见图1。

由图1可知，
在1 500 bp左右得到特异性的目的条带。

2.3 基于细菌16S rDNA的系统发育进化树利用DNAStar程序中的Clustal V方法，对测序得到的乳酸菌16S rDNA序列和GenBank中已发表的相关种属细菌的16S rDNA序列构建系统发育进化树，结果见图2。

由图2可知，分离菌与GenBank中已登录的短乳杆菌（Lactobacillus breris）HDRS2分离株聚在一起，表明从酸驼乳中分离到的该株乳酸菌为短乳杆菌（Lactobacillus breris），将其
命名为Lactobacillus breris LT。

2.4 Lactobacillus breris LT代谢产物的抑菌效果利用牛津杯法测定Lactobacillus
breris LT代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌
的抑菌圈直径，结果见图3和表1。

由图3可以看出，在接种了4种指示菌的培
养基上，Lacto- bacillus breris LT代谢产物周围均产生了明显的抑菌圈。

由表1
可以看出，Lactobacillus breris LT菌株代谢产物对大肠杆菌和单增李斯特菌的抑菌效果优于对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌的抑菌效果。

2.5 用酶处理后的Lactobacillus breris LT代谢产物的抑菌效果用酶处理后的Lactobacillus breris LT代谢产物对指示菌的抑菌效果测定结果见表2。

由表2可知，Lactobacillus breris LT上清液加入胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，其对4种指示菌的抑菌效果没有显著的变化。

2.6 Lactobacillus breris LT的耐酸特性评价从表3可以看出，当MRS培养基的pH值为1.0时，Lactobacillus breris LT的存活率为0；当pH值升高至
3.0时，存活率也提高到72.93%。

2.7 Lactobacillus breris LT的耐胆盐特性评价从表4可以看出，当MRS培养基
中的牛胆盐浓度为 0.1%时，Lactobacillus breris LT的存活率为100%；当牛胆
盐浓度升高至0.3%时，存活率下降至49.23%。

16S rDNA是原核生物在漫长进化过程中十分保守的序列，素有“细菌化石”之称。

国内外应用16S rDNA鉴定乳酸种属的例子很多。

1998年，Parola等［3］就利用16S rDNA序列分析技术成功地从患有败血症的人体中分离并鉴定出干酪乳杆菌。

2003年，Byun等［4］对干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和瑞士乳杆菌的16S rDNA和23S rDNA区间的一个片段进行比较，鉴定出了一株鼠李糖乳杆菌。

2000年，方祥等［5］通过选择性培养基从健康鸡的粪便中分离出6株乳酸菌，
其中经过传统的生物学鉴定只能确定O-2菌株是具有潜在益生特性的乳杆菌。

王
晓丽等［6］对泡菜和仔猪粪便中的乳酸菌进行分离鉴定时，将传统的生物学细菌鉴定方法与16S rDNA分子生物学方法结合来确定乳酸菌的种属，从而筛选出具
有优良益生特性的乳酸菌。

刘俊文等［7］结合传统生理生化鉴定方法，利用16S rDNA序列分析方法详细地确定了益生菌L.casei Zhang在干酪乳杆菌中的分类学地位，并且认为该菌株属于干酪乳杆菌干酪亚种。

该研究利用NCBI上的BLAST方法，对乳酸菌分离株的16S rDNA测序结果和GenBank中公布的细菌16S rRNA序列进行同源性比较分析；应用DNAStar程
序中的MegAlign软件包进行分析，通过Clustal V法构建系统进化树。

结果表明，筛选菌株与短乳杆菌HDRS2分离株位于同一支，且表型上也吻合，最后将其鉴定为短乳杆菌，并命名为Lactobacillus breris LT。

传统的表型特征、生理生化特性及糖发酵仍是现代乳杆菌分类的重要指标。

但乳杆菌属内种的数目庞大，且种间差异较大，相互亲缘关系迥异。

因此，传统的鉴定方法存在局限性。

利用现代分子生物学方法会使鉴定结果更加可靠。

16S rDNA序列分析这一分子生物学方法，将在乳杆菌的分类鉴定中起到越来越重要的作用。

Lactobacillus breris LT发酵上清液对常见的4株肠道性致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌具有明显的抑菌效果，这与乳酸菌本身产生的代谢产物的抑菌物质，如乳酸、乙酸、过氧化氢、细菌素、双乙酰等有关［8］。

Lactobacillus breris LT上清液加入胃蛋白酶和胰蛋白酶进行处理后，其
对4种指示菌的抑菌效果没有显著的变化，说明Lactobacillus breris LT产生的
代谢产物的抑菌物质不属于蛋白质类，因此，对胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感。

国内外的很多研究也证实乳酸菌具有抑菌特性。

Talarico等［9］在研究罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）时发现，其对酵母、真菌等表现出抑菌作用是因为产生了一种低分子量的抑菌物质reutein。

王小红等［10］研究表明，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌对金黄色葡萄球菌的抑菌效果不同，说明不同种属的乳酸菌产生的抑菌代谢产物不同，导致其对病原菌的抑制活性和抑制机理也不相同。

乳酸菌进入人和动物的肠道才能起到益生作用，但进入肠道必须首先经过胃和十二
指肠，需要耐受胃内较低的pH值环境及由肝脏分泌到十二指肠的高浓度胆盐。

该试验中Lactobacillus breris LT在pH值为1.0的MRS培养基上不能存活，在pH值为2.0的MRS培养基上能够存活，并且存活率随着pH值的升高而升高。

Lactobacillus breris LT在含牛胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%的MRS培养基上均表现出了较强的耐受能力，提示Lactobacillus breris LT可以进入肠道，改变肠道的微生态环境，抵抗致病性微生物的感染，维持肠道菌群平衡，在动物肠道中发挥益生作用。

骆驼主要分布在我国北方以蒙古族为主的少数民族地区，这些地区的骆驼乳制品种类繁多，其中隐藏着大量未知的、具有优良特性和益生作用的乳酸菌。

从中分离筛选益生乳酸菌并开发其益生作用，对于人类健康及畜禽疾病的防治具有重要意义及应用价值。

【相关文献】
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［10］王小红，谢笔钧，史贤明，等.乳酸菌对金黄色葡萄球菌生物拮抗作用的初步研究［J］.食品工业科技，2005，26（1）：68-73.。