无氮饲粮对肉鸡盲肠微生物菌群结构及内源氨基酸基础损失量的影响

无氮饲粮对肉鸡盲肠微生物菌群结构及内源氨基酸基础损失量
的影响
蒋纯卫;呙于明;王永伟;雷廷;郭双双
【摘要】The purpose of this study was to explore the effects of nitrogen-free diets on cecal microflora and endogenous amino acid basal losses of broilers aged 14 and 35 days. A total of 308 Male Ross broiler chickens, aged 10 and 31 days, respectively, were chosen and randomly assigned into two dietary treatments, in which one was fed a conventional diet and the other was fed a nitrogen-free diet for 4 days. Every treatment contained five replicates with 12 chickens on day 10 and 6 chickens on day 31 per replicate. The results showed that endogenous basal losses of most amino acids determined by excreta-based assay were significantly higher than those determined by ileum digesta-based assay in broilers aged 14 and 35 days (P<0.05 or P<0.01). Compared with the conventional diet, there were some changes of DGGE predominant bands of cecal microflora 16S rDNA V3 region in broilers fed the nitrogen-free diet aged 14 and 35 days, the 72% and 39% of total gray value of predominant bands changed respectively for broilers fed the nitrogen-free diet aged 14 and 35 days. On day 14, there was no significant difference in cecal digesta weight and ammoniacal nitrogen concentration in broilers between nitrogen-free diet group and conventional diet group (P >0. 05) , but the concentrations of butyric acid (P< 0.01) , isobutyric acid (P< 0.05) and valeric acid (P < 0. 05) in cecum digesta of broilers were significantly decreased and propionic
acid concentration was significantly increased (P <0. 01) by the nitrogen-free diet compared with the conventional diet. On day 35, compared with conventional diet group, cecal digesta weight of broilers in the nitrogen-free diet group was significantly increased, and the concentrations of ammoniacal nitrogen, acetic acid, isobutyric acid, valeric acid and isovaleric acid were significantly decreased (P<0.01). In conclusion, endogenous basal losses of most amino acids measured by excreta-based assay are higher than those measured by ileal digesta-based assay when broilers are fed the nitrogen-free diet. Some predominant species of cecal microflora should change after broilers are fed the nitrogen-free diet for 4 days.
[ Chinese Journal of Animal Nutrition, 2012, 24 (10) : 1878-1887 ]%本试验旨在研究无氮饲粮对14日龄和35日龄肉鸡盲肠微生物菌群结构及内源氨基酸基础损失量的影响.分别选用10日龄和31日龄罗斯(Ross) 308雄性肉鸡,随机分为2个组:常规饲粮组和无氮饲粮组,每组5个重复,其中10日龄时每个重复12只鸡,31日龄时每个重复6只鸡,试验期均为4d.结果表明:肉鸡14日龄和35日龄时,收粪法所得大多数氨基酸内源基础损失量均显著或极显著高于回肠食糜法(P＜0.05或P ＜0.01).相对常规饲粮,无氮饲粮改变了14日龄和35日龄肉鸡盲肠微生物16S rDNA V3高变区变性梯度凝胶电泳图谱的优势条带,其中14日龄和35日龄发生变化的优势条带灰度值占其整个优势条带总灰度值的比例分别为72％、39％.与常规饲粮相比,无氮饲粮对14日龄肉鸡盲肠食糜重、氨态氮浓度没有显著影响(P＞0.05),但极显著降低了盲肠食糜中丁酸浓度(P＜0.01),显著降低了异丁酸和戊酸浓度(P＜0.05),极显著增加了丙酸浓度(P＜0.01).无氮饲粮组35日龄肉鸡盲肠食糜重极显著高于常规饲粮组(P＜0.01),盲肠食糜氨态氮、乙酸、异丁酸、戊酸、异戊酸浓度则极显著降低(P＜0.01).综上所述,采用无氮饲粮测定内源氨基酸基础损失量时,
收粪法所得大多数氨基酸内源基础损失量显著高于回肠食糜法.饲喂无氮饲粮4d后,肉鸡盲肠食糜原有微生物优势菌群发生改变.
【期刊名称】《动物营养学报》
【年(卷),期】2012(024)010
【总页数】10页(P1878-1887)
【关键词】肉鸡;盲肠微生物;内源氨基酸基础损失;回肠食糜法;收粪法
【作者】蒋纯卫;呙于明;王永伟;雷廷;郭双双
【作者单位】中国农业大学动物科技学院,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业大学动物科技学院,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中
国农业大学动物科技学院,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业大学
动物科技学院,动物营养学国家重点实验室,北京100193;中国农业大学动物科技学院,动物营养学国家重点实验室,北京100193
【正文语种】中文
【中图分类】S831.5
准确估测内源氨基酸基础损失量是测定饲料标准氨基酸消化率的一大关键，内源氨基酸基础损失量的测定方法也是近年动物营养研究的热点［1］。

20世纪90年代，收粪法因具有简便可行且结果较饲料直接物化分析法更有效等优点而被广泛采纳，但也因受盲肠微生物影响一直备受争议。

当前，无氮饲粮法研究盲肠微生物对氨基酸基础内源损失的影响主要有3种方法:完整成年公鸡、去盲肠成年公鸡强饲收粪
法［2］;无菌鸡、传统鸡收粪法;指示剂法同时收取肉鸡回肠食糜、粪进行比较分
析。

对5周龄肉鸡的研究表明，收粪法所得天冬氨酸、谷氨酸基础内源损失显著高于回肠食糜法，其余没有显著差异［4］。

上述试验只是采用了传统方法间接研究了盲肠微生物对内源氨基酸损失的影响，所以本试验拟从微生物遗传标志分子16S rDNA、微生物关键代谢物氨态氮和挥发性脂肪酸(VFA)等方面进一步探讨盲肠微生物对内源氨基酸损失量的影响。

因此，本试验选用10日龄和31日龄雄性肉鸡，饲喂无氮饲粮，旨在通过对回肠食糜法、收粪法所得的内源氨基酸基础损失量进行比较研究，同时采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析盲肠微生物对收粪法测定内源氨基酸基础损失量的影响，为肉鸡饲料内源氨基酸基础损失量的测定提供理论指导。

1 材料与方法
1.1 试验设计
分别选用10日龄和31日龄罗斯(Ross)308雄性肉鸡120只和60只，均随机分为常规饲粮组和无氮饲粮组，每组5个重复，其中10日龄时每个重复12只鸡，31日龄时每个重复6只鸡，正式试验期均为4 d。

试验期常规饲粮组肉鸡饲喂含有二氧化钛指示剂的常规饲粮，无氮饲粮组肉鸡饲喂含有二氧化钛指示剂的无氮饲粮，添加量均为0.5%。

非正式试验期肉鸡均饲喂不含指示剂的常规饲粮。

肉鸡除试验期有特殊饲喂要求外，其余时间均自由采食，充足饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。

常规饲粮参照中国鸡饲养标准(NY/T 33—2004)配制，无氮饲粮参照Adedokun等［1］推荐的配方配制，含指示剂的常规饲粮组成及营养水平、无氮饲粮组成分别见表1和表2。

表1 常规饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of conventional diets(air－dry basis) %1)微量元素预混料为每千克饲粮提供The trace element premix provides the following per kg of diets:Cu 8 mg，Zn 75 mg，Fe 80 mg，Mn 100 mg，Se 0.15 mg，I 0.35 mg。

表2同。

The same as Table 2.2)维生素预混料为每千克饲粮提供The vitamin premix provides the following per kg of diets:VA 12 500 IU，VD3 2 500 IU，VE 18.75 mg，VK32.65 mg，VB12 mg，VB26 mg，VB66 mg，VB120.025 mg，生物素 biotin 0.032 5 mg，叶酸 folic acid 1.25 mg，泛酸 pantothenic acid
12 mg，烟酸 nicotinic acid 50 mg。

表2同。

The same as Table 2.原料Ingredients玉米Corn 0.45 0.40 53.86 56.43大豆粕Soybean meal 34.51 32.79玉米蛋白粉Corn gluten meal 3.86 2.59大豆油Soybean oil 3.00 4.00磷酸氢钙CaHPO4 1.92 1.63石粉Limestone 1.24 1.15 L－赖氨酸盐酸盐 L－Lys·HCl 0.12食盐NaCl 0.30 0.30氯化胆碱Choline chloride(50%) 0.26 0.26
微量元素预混料Trace element premix1) 0.20 0.20 DL －蛋氨酸 DL－Met 0.17 0.10苏氨酸Thr 0.01抗氧化剂Antioxidant 0.03 0.03维生素预混料Vitamin premix2) 0.02 0.02二氧化钛Titanium dioxide 0.50 0.50合计Total 100.00 100.00营养水平Nutrient levels代谢能ME/(MJ/kg) 12.28 12.62粗蛋白质CP 21.50 20.00赖氨酸Lys 1.15 1.00蛋氨酸Met 0.50 0.40钙Ca 1.00 0.90有效磷AP
1.2 样品采集与制备
在10日龄和31日龄时，对肉鸡进行饥饿处理，其中10日龄饥饿4 h，31日龄
饥饿8 h，饥饿后称重，剔除体重极大和极小的鸡只，待试验鸡只体重排序后按照拉丁方原则，使得每个重复涵盖体重从高到低的鸡只，每个重复平均体重尽量一致。

随后开始正式试验，无氮饲粮组肉鸡饲喂含指示剂的无氮饲粮，常规饲粮组肉鸡饲喂含指示剂的常规饲粮，共饲喂4 d。

在13日龄和34日龄时，肉鸡粪便用铺有尼龙纸的粪盘收集，收12 h，每隔2 h
收1次，收集时将羽毛、饲料、皮屑等清除，收集后的粪便立即放入－20℃冰箱
保存，12 h的粪便统一混匀后取部分冻干。

室温回潮24 h后，将粪便粉碎过60
目分析筛，密封样品，保存在－20℃冰箱待测。

表2 无氮饲粮组成Table 2 Compositon of the nitrogen－free diet %玉米淀粉Corn starch 20.07葡萄糖Glucose 64.00羧甲基纤维素Carboxymethylcellulose 5.00大豆油Soybean oil 5.00微量元素预混料Trace element premix1) 0.20维生素预混料Vitamin premix2) 0.02磷酸二氢钙
Ca(H2PO4)2 1.90碳酸氢钠NaHCO3 0.75氯化钾KCl 0.29氧化镁MgO 0.20氯化胆碱Choline chloride(50%) 0.50石粉Limestone 1.30碳酸钾K2CO3 0.26抗氧化剂Antioxidant 0.01二氧化钛Titanium dioxide 0.50合计Total 100.00 在14日龄和35日龄时，肉鸡先饥饿2 h，自由采食4 h后翅下静脉注射戊巴比妥钠麻醉剂麻醉所有鸡只，剂量为30 mg/kg体重，保证深度麻醉后立即屠宰，分离整段回肠。

除去最后2(14日龄肉鸡)或4 cm(35日龄肉鸡)的回肠肠段再对折为2个部分，取后1/2段回肠食糜用于后续分析。

将这部分肠段食糜用蒸馏水冲洗至铝盒中。

每个重复所有食糜混合成一个样品。

样品收集好后，冻干。

后续操作与上述粪便的方法一致。

取出左右盲肠，将左侧盲肠称重，两侧盲肠液氮冷冻后保存在－80℃冰箱。

测定时将每个重复的左右盲肠食糜混合为一个待测样品，用于氨态氮浓度、VFA浓度、DGGE 谱带图分析［5］。

1.3 检测指标与方法
1.3.1 盲肠食糜重量
将左侧盲肠取出，称重(W1);在超净台上解冻后，用手挤出全部食糜，之后再称空盲肠重(W2)，两者之差为盲肠食糜重量(△W=W1－W2)。

1.3.2 无氮饲粮水分测定
无氮饲粮水分测定参照国标GB/T 6435—2006。

1.3.3 样品中二氧化钛含量测定
样品中二氧化钛含量参照Short等［6］和邓雪娟等［7］所述方法进行测定。

1.3.4 样品中氨基酸含量测定
样品中氨基酸含量用氨基酸自动分析仪进行测定，检测单位为农业部饲料效价与安全监督检验测试中心(北京)，采用一般酸水解法，具体参照国标GB/T 18246—2000。

1.3.5 盲肠食糜氨态氮、VFA浓度测定
盲肠食糜氨态氮浓度测定采用Broderick等［8］所述方法，VFA浓度测定采用气相色谱法，检测单位为中国农业大学肉牛研究中心。

样品前处理:0.5 g盲肠食糜4℃解冻后，以W/V=1∶2比例用超纯水稀释，加入氧化锆珠子0.1 g，涡旋分散混匀食糜，20 000×g 4℃离心20 min后取上清［9］。

后续试验步骤参照高巍［10］所述。

1.3.6 盲肠食糜16S rDNA V3高变区DGGE条带谱比较
盲肠食糜总DNA用QIAamp DNA Stool Mini Kit(货号:51504)提取。

V3区通用引物为357F－GC(5'－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGG GGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAG CAG－3') 和 518R(5'－GTATTACCGCGGCTGCTGG－3')［11］。

PCR 反应为50 μL 体系，模板:1
μL(100 ng);TaKaRa Tap(5 U/μL):0.25 μL;10 ×PCR Buffer(Mg+Plus):5
μL;dNTP Mixture(各2.5 mmol/L):4 μL;引物1(10 μmol/L):1 μL;引物 2(10
μmol/L):1 μL;牛血清白蛋白(BSA)(5 μmol/L):1 μL;dd H2O:36.75 μL。

PCR 扩增
程序如下，94℃初始热变性5 min;10个touchdown循环，第1个循环条件
为:94℃热变性30 s，61 ℃复性30 s，72 ℃ 延伸1 min，后面每个循环复性温度降0.5℃;接着22个常规循环:94℃热变性 30 s，56 ℃ 复性 30 s，72 ℃ 延伸 1 min［12］。

取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，后面取20 μL PCR 产物(约1 200 ng DNA)进行DGGE 电泳，DGGE 电泳仪器为 Bio－Rad Dcode，胶变性浓度35% ～55%，电泳条件为60℃、70 V、20 h。

电泳完，胶在
GelRed以1∶100 000比例用产纯水稀释配成的染液里染色30 min，用凝胶成像仪器(UVP EC3 Bioimaging System，美国)拍照，Quantitiy One软件进行黑白
图转换。

1.4 内源氨基酸基础损失计算公式
内源氨基酸基础损失的计算公式为:
式中:EAA表示内源氨基酸基础损失;AA表示无氮饲粮饲喂肉鸡的回肠食糜或粪中
某氨基酸含量(mg/kg，冻干基础);TDC1表示无氮饲粮中二氧化钛含量(mg/kg，
干物质基础);TDC2表示无氮饲粮饲喂肉鸡的回肠食糜或粪中二氧化钛含量(mg/kg，冻干基础)。

1.5 DGGE图谱分析
利用Quantity One软件进行条带Match分析，超出胶图全长2%的垂直距离差
被视作不同条带。

允许2%距离差是考虑到同一板胶不同条带可能会有迁移误差。

利用Quantity One软件中Gauss Model Bands命令计算条带灰度值，并用Gauss Model Trace表示，单位为INT×mm。

随后依据具体情况选取组内共有且灰度值在所在泳道属最亮的9～15条记录灰度值，以所选条带总灰度值作为分母，求所选条带灰度值百分比，计算各饲粮所选条带灰度值百分比的平均值。

这样处理主要考虑到光度计计量DNA浓度、PCR反应、DGGE操作等产生的误差不适合
不同样品进行量的比较，所以条带灰度值只在同一条泳道内进行比较，后转化为条带灰度值百分比这一相对量用于观察差异条带在所属样品中的丰度情况。

1.6 数据统计分析
试验数据采用SPSS 17.0软件中独立样本T－test法进行显著性分析。

结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果
2.1 14日龄和35日龄肉鸡回肠食糜与粪中内源氨基酸基础损失量的比较
由表3可知，与回肠食糜法相比，收粪法所得的14日龄肉鸡组氨酸内源基础损失量没有显著变化(P＞0.05)，其余均极显著升高(P＜0.01);收粪法所得的35日龄肉
鸡异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸内源基础损失量没有显著变化(P＞0.05)，
其余均显著升高(P＜0.05);其中丙氨酸基础损失量提高最多，在14日龄和35日龄均高达100%左右。

2.2 无氮饲粮对14日龄和35日龄肉鸡盲肠食糜重、氨态氮和VFA浓度的影响
由表4可知，在14日龄时，与常规饲粮组相比，无氮饲粮组肉鸡盲肠食糜重、氨态氮浓度没有显著变化(P＞0.05)，盲肠食糜内丁酸浓度极显著降低(P＜0.01)，异丁酸、戊酸浓度显著降低(P＜0.05)，丙酸浓度极显著升高(P＜0.01)。

在35日龄时，无氮饲粮组肉鸡盲肠食糜重较常规饲粮组极显著升高(P＜0.01)，氨态氮、乙酸、异丁酸、异戊酸和戊酸浓度均极显著降低(P＜0.01)。

2.3 饲喂常规饲粮与无氮饲粮的14日龄和35日龄肉鸡盲肠食糜微生物16S rDNA V3高变区DGGE图谱条带比较分析
由图1和表5可知，在14日龄时，常规饲粮、无氮饲粮各自灰度值百分比最高的条带存在差异，常规饲粮所特有的其余条带灰度值百分比分别为8%、15%、12%、4%，无氮饲粮的分别为6%、9%、5%、10%。

在35日龄时，常规饲粮所特有的条带中灰度值百分比最高的为11%，其余为7%、7%、5%;无氮饲粮所特有的条
带中灰度值百分比最高的为12%，其余为10%、6%、11%。

3 讨论
3.1 内源氨基酸基础损失量测定的影响因素
内源氨基酸基础损失量受动物饲粮类型、日龄和测定方法等因素的影响［1］。

Adedokun等［13］及Golian等［17］研究表明，无氮饲粮法与酪蛋白梯度回
归法测得的内源氨基酸基础损失量差异不显著，他们认为无氮饲粮法是简便可行的
测定内源氨基酸基础损失量的方法。

Ravindran等［18］研究发现采用18%酪蛋白作为饲粮唯一蛋白质来源时，35日龄肉鸡内源氨基酸损失量显著高于14日龄。

Adedokun等［13］采用无氮饲粮法对不同日龄内源氨基酸基础损失量进行测定
发现，21日龄与14日龄内源氨基酸基础损失没有显著差异，但5日龄要显著高
于上述2个日龄。

将本试验结果与之前已有的无氮饲粮法同一日龄的数据进行比
较发现，本试验35日龄数据与Ravindran等［18］研究数据基本一致，14日龄数据与 Adedokun等［13］研究数据差异显著(表6)，推测产生差异的原因可能
与外源指示剂种类、基础饲粮中是否添加抗生素、麻醉方式等有关。

表3 14日龄和35日龄肉鸡回肠食糜法和收粪法基础内源氨基酸基础损失量比较Table 3 Comparison of ileal digesta－based and excreta－based endogenous amino acid basal losses of broilers aged 14 and 35 days g/kg DM intakeIDBA表示回肠食糜法，EDBA表示收粪法。

同一日龄同行数据肩标无
字母表示差异不显著(P＞0.05)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P＜0.01)。

表4同。

IDBA means ileal digesta－based assay，and EDBA means excreta－based assay.In the same row，values of the same age without letter superscripts mean no significant difference(P
＞0.05)，while with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P＜0.01).The same as Table 4.回肠食糜法IDBA氨基酸AA回肠食糜法IDBA收粪法EDBA P值P值P－value收粪法EDBA P－value必需氨基酸＜0.01 219±17 230±38 0.570 EAA精氨酸Arg
283±38B 453±58A ＜0.01 268±39B 440±90A ＜0.01组氨酸His 156±18
175±76 0.616 130±39B 560±100A ＜0.01异亮氨酸Ile 275±35B 440±59A ＜0.01 238±23 323±90 0.103亮氨酸Leu 493±57B 745±86A ＜0.01 529±54
530±115 0.989赖氨酸Lys 301±44B 554±77A ＜0.01 280±37b 449±102a ＜0.05苯丙氨酸Phe 238±33B 354±46A ＜0.01 217±23B 319±55A ＜0.01苏氨酸Thr 601±54B 702±29A ＜0.01 586±69 685±70 0.054缬氨酸Val 385±41B 585±64A ＜0.01 356±37b 518±96a ＜0.05非必需氨基酸NEAA天门冬氨酸Asp 638±64B 978±119A ＜0.01 582±59b 898±171a ＜0.05丝氨酸Ser
442±41B 549±21A ＜0.01 456±47B 589±57A ＜0.01谷氨酸Glu 713±88B 1 262±164A ＜0.01 677±58B 1 080±185A ＜0.01脯氨酸Pro 390±41B
536±36A ＜0.01 348±37B 599±62A ＜0.01甘氨酸Gly 359±36——343±26 ——丙氨酸Ala 323±36B 637±87A ＜0.01 327±31B 696±108A ＜0.01酪氨
酸Tyr 235±29B 360±51A
据Adedokun等［1］综述可知，影响内源氨基酸基础损失测定值的因素如下:黏
蛋白周转速度、饲粮蛋白质或氨基酸水平、饲粮纤维水平、饲粮植酸含量、指示剂种类、肠道健康、动物日龄和品种及测定方法。

比较本试验与Adedokun等［13］的试验方案，其中所用肉鸡品种(Ross 308)、测定方法(无氮饲粮法)、饲粮纤维水平(占整个饲粮的5%)、肉鸡日龄(14日龄)是一致的;在指示剂方面，Adedokun等［13］采用三氧化二铬，本试验采用二氧化钛，Selle等［14］通过对已有文献比较发现，较三氧化二铬，二氧化钛及酸不溶灰分能更显著地指示出饲粮中添加植酸酶后提高的氨基酸消化率，且Oberleas等［15］研究表明三氧化二铬在食糜中分布不均;另外，本试验中因需测定微生物指标，基础饲粮中没有添加任何抗生素，
这可能会导致定植于肠道的微生物数量增多，黏膜层增厚，黏蛋白周转速度增加;
在麻醉方式方面，Moughan等［16］试验中发现戊巴比妥钠麻醉法一直要优于
二氧化碳麻醉法。

表4 无氮饲粮对14日龄和35日龄肉鸡盲肠食糜重、氨态氮和VFA浓度的影响Table 4 Effects of the nitrogen－free diet on cecal digesta weight，
ammoniacal nitrogen and VFA concentrations of broilers aged 14 and 35 days14日龄14 days of age 35日龄35 days of age项目Items常规饲粮Conventional diet无氮饲粮Nitrogen－free diet P值P值P－value常规饲粮Conventional diet无氮饲粮Nitrogen－free diet P－value盲肠食糜重 Cecal digesta weight/g 1.0±0.5 0.8±0.4 0.231 4.1±1.9B 6.1±3.4A ＜0.01氨态氮Ammoniacal nitrogen/(μmol/g) 44.0±5.6 35.9±8.3 0.106 40.8±3.8A
26.2±3.0B ＜0.01乙酸Acetic acid/(μmol/g) 29.3±4.0A 20.1±1.5B ＜0.01 41.9±7.5A 19.9±3.6B ＜0.01丙酸Propionic acid/(μmol/g) 1.3±0.3B
2.7±0.7A ＜0.01
3.8±0.6 3.3±0.6 0.226异丁酸Isobutyric acid/(μmol/g)
0.4±0.2a 0.1±0.0b 0.010 0.6±0.2A 0.1±0.0B ＜0.01丁酸 Butyric
acid/(μmol/g) 5.6±1.4 3.5±1.8 0.066 8.1±2.6 7.9±2.8 0.900异戊酸 Isovaleric acid/(μmol/g) 0.3±0.1 0.2±0.2 0.432 0.5±0.1A 0.1±0.0B ＜0.01戊酸 Valeric acid/(μmol/g) 0.4±0.1a 0.2±0.1b 0.015 0.7±0.2A 0.3±0.1B ＜0.01
图1 饲喂常规饲粮与无氮饲粮的14日龄和35日龄肉鸡盲肠食糜微生物16S rDNA V3高变区DGGE图谱条带Fig.1 DGGE bands of highly variable region V3 in microbial 16S rDNA from cecum of broilers fed with the conventional diet and the nitrogen－free diet at 14 and 35 days of age1－1、1－2 为 14 日龄常规饲粮组，2－1、2－2 为 14 日龄无氮饲粮组;3－1、3－2 为 35 日龄常规饲粮组，4－1、4－2 为 35 日龄无氮饲粮组。

相同数字标识左侧组内同一水平位置上的条带。

1－1 and 1－2 bands，2－1 and 2－2 ones，3－1 and 3－2 ones，4－1 and 4－2 ones are from broilers aged 14 days fed the conventional diet，aged 14 days fed the nitrogen－free diet，aged 35 days fed the conventional diet，aged 35 days fed the nitrogen－free diet，respectively.The same number means the bands with the same horizontal
position in a group.
表5 饲喂常规饲粮与无氮饲粮的14日龄和35日龄肉鸡微生物16 S rDNA V3高变区DGGE主要条带灰度值百分比及特异性标识Table 5 Specific identity and percentage of the main bands from DGGE of highly variable region V3 in microbial 16S rDNA from cecum of broilers fed the conventional diet and the nitrogen－free diet at 14 and 35 days of age上标字母a表示14日龄常规饲粮组较同一日龄无氮饲粮组所特有的条带，b、c、d分别表示14日龄无氮饲粮组、35日龄常规饲粮组、35日龄无氮饲粮组经类似比较后所特有的条带。

The letter a means the special bands from broilers aged 14 days fed the conventional diet compared with ones aged 14 days fed the nitrogen－free diet，b，c and d mean the special bands from broilers aged 14 days fed the nitrogen－free diet，aged 35 days fed the conventional diet and aged 35 days fed the nitrogen－free diet.14日龄14 days of age常规饲粮无氮饲粮Conventional diet条带编号No.of bands百分比百分比
Percentage/%Nitrogen－free diet条带编号No.of bands Percentage/%35日龄35 days of age常规饲粮无氮饲粮Conventional diet条带编号No.of bands 百分比百分比Percentage/%Nitrogen－free diet条带编号No.of bands Percentage/%1 8a 1 6b 1 11c 27 2 15a 2 9b 2 7c 2 4 3 1 12a 3 5b 3 29 3 4 4 7 4 10b 4 2 4 3 5 15 5 6 5 1 5 11 6 4a 6 8 6 12 6 4 7 8 7 7 7 7c 7 10d 8 7 8 6 9 8 9 8 4 23a 9 2 9 3 9 4 10 42b 10 5c 10 6d 11 8 11 11d 12 5 12 12d
表6 不同试验中回肠食糜法测定饲喂无氮饲粮的肉鸡内源氨基酸基础损失量比较Table 6 Comparision of ileal digesta－based endogenous amino acid basal losses of broilers fed the nitrogen－free diet in different experiments
mg/kg DM intake14日龄14 days of age氨基酸AA 35日龄35 days of age
本试验数据Values in this experiment Adedokun等［13］本试验数据Values in this experiment Ravindran等［18］天门冬氨酸Asp 638 337 582 607苏氨酸Thr 601 274 586 512丝氨酸Ser 442 230 456 424谷氨酸Glu 713 383 677 721脯氨酸Pro 390 215 348丙氨酸Ala 323 170 327 293缬氨酸Val 385 205 356 417异亮氨酸Ile 275 153 238 287亮氨酸Leu 493 241 529 439酪氨酸Tyr 235 116 219 253苯丙氨酸Phe 238 154 217 287组氨酸His 156 71 130 158赖氨酸Lys 301 178 280 209精氨酸Arg 283 156 269 280
3.2 盲肠微生物对收粪法测定内源氨基酸基础损失量的影响
本试验结果表明，收粪法相对于回肠食糜法可极显著地提高绝大多数氨基酸内源基础损失，产生这一差异的原因可能是盲肠微生物有较强的蛋白质合成活动和较弱的蛋白质发酵活动。

在家禽体内，尿酸逆流进入盲肠后可快速分解为尿素，进而转化为氨态氮［19－20］。

微生物可利用糖类代谢所产生的碳链骨架和氨态氮合成其所需的所有氨基酸和其他含氮化合物［21］。

有研究者用肥育猪瘘管法直接向大肠中加入若干淀粉，结果表明，随着微生物可利用能量的增多，大肠中微生物利用氨态氮和胺从头合成微生物蛋白质活动增强［22］。

本试验结果表明，相对于常规饲粮组，无氮饲粮组14日龄肉鸡氨态氮浓度没有显著变化，35日龄氨态氮浓度极显著降低，但盲肠食糜重极显著增加。

同时，无氮饲粮的主要成分为葡萄糖、淀粉等易被微生物有效利用的能量底物，饲喂无氮饲粮，肉鸡盲肠食糜主要成分应是葡萄糖、淀粉。

因此推测，饲喂无氮饲粮，肉鸡盲肠微生物有充足的能量碳水化合物和一定量的氨态氮进行蛋白质合成作用，可能使粪中氨基酸浓度增加。

另有研究表明:谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸是从成年公鸡排泄物中直接分离纯化出的微生物细胞中含量最丰富的3种氨基酸［23］，摩尔百分比都在13%左右。

本试验结果发现，在14日龄和35日龄时，收粪法中所得肉鸡排泄物中谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸内源基础损失量显著或极显著高于回肠食糜法，绝对量差值在所有氨
基酸差值中属于最大的几个，与文献［23］所述基本一致。

这也表明饲喂肉鸡无
氮饲粮，粪中微生物蛋白质浓度可能高于回肠食糜。

在14日龄和35日龄时，相
对常规饲粮，无氮饲粮组肉鸡盲肠食糜蛋白质发酵分解的标志性脂肪酸异丁酸、戊酸、异戊酸含量，至少有2种无论从浓度还是每只鸡盲肠总量上都显著降低，这
表明无氮饲粮使得肉鸡盲肠微生物发酵蛋白质生成异丁酸、戊酸、异戊酸的作用显著减弱。

普通 PCR、DGGE能将16S rDNA含量占某微生态环境整个微生物16S rDNA总量超过1%的微生物检测出来［24］，各种微生物16S rDNA拷贝数虽
然存在一定差异，但是极少会引起10倍数量级的差别［25］，因此可将能在DGGE胶上探测出来的条带对应的微生物纳为在某个微生态环境下数量占优势的
优势菌群。

本试验中，在14日龄时，无氮饲粮组5条优势条带区别于常规饲粮组，同时不具备常规饲粮组所拥有的5条优势条带，这些差异条带灰度值占常规饲粮
组优势条带总灰度值的59%，占无氮饲粮组优势条带总灰度值的72%。

在35日
龄时，无氮饲粮组4条优势条带区别于常规饲粮组，同时不具备常规饲粮组所拥
有的4条优势条带，这些差异条带灰度值占常规饲粮组优势条带总灰度值的30%，占无氮饲粮组优势条带总灰度值的39%。

因此，DGGE图谱结果分析表明，饲喂
4 d无氮饲粮能改变14日龄和35日龄肉鸡原有的盲肠微生物优势菌群，且14日龄改变尤为明显。

综上所述，相对于回肠食糜法，收粪法测得的内源氨基酸基础损失量显著升高的原因可能与肉鸡采食4 d无氮饲粮后，盲肠原有微生物优势菌群
发生改变，微生物蛋白质合成作用增强有关。

但具体哪些微生物最终引起这一变化，还需要通过DGGE差异条带回收克隆测序作进一步研究。

4 结论
相对于回肠食糜法，收粪法测得的大多数氨基酸内源基础损失量显著升高。

肉鸡采食4 d无氮饲粮后，盲肠原有微生物优势菌群发生改变。

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