盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响

一、实验课题名称：
盐胁迫对植物体内游离脯氨酸积累的影响
二、文献综述：
[1]作物生长的环境并不总是适宜的。

干旱、炎热、霜冻、盐碱、涝灾，以与环境污染、病虫害等都会对作物的生长造成不利的影响。

作物的抗逆性是整体性的。

可能存在着共同的机制以抵御整个生育期的各种逆境胁迫，现综述如下
l．渗透调节
己有大量研究表明，渗透调节是抗旱性的一种重要机制。

水分亏缺条件下，叶片和根系渗透调节的生理效应主要是以下两个方面：一是增加吸收，保持膨压，缓和脱水胁迫，改善细胞水分状况；二是改善水分胁迫植物的生理功能，维持一定的生长和光合能力，提高植物在低水势下的生存能力。

Jordan〔1984〕试图从植株整体系统上量化渗透调节的作用，他们用模型模拟得出如下结论，渗透调节的作用并不能找出影响产量的复杂因素，在干旱条件下由于缺乏渗透调节能力，小麦虽然有大量的根系仍不能正常生长〔Mcgown，l984〕。

李德全等〔1994〕在盆栽试验条件下研究表明，抗旱性强的品种渗透调节能力均大于抗旱性弱的品种。

李秀菊〔1992〕在大田试验条件下，测定了3个抗寒性不同冬小麦品种越冬期抗寒力变化与渗透调节的关系。

结果表明，抗寒锻炼期间冬小麦抗寒能力逐渐提高，抗寒性越强的品种增强的幅度愈大。

伴随抗寒力的增强，渗透势降低，抗寒力愈强的品种下降幅度愈大。

与渗透变化有关的可溶性糖等渗透物和水分状况均向降低渗透势的方向发展。

2．脯氨酸
有研究表明，通常萎蔫较快的作物脯氨酸积累也较快。

Aspinall和Paleg(1987〕讨论了胁迫条件下脯氨酸积累作为一个抗旱因素的可能性，得出结论如下，脯氨酸是一种细胞亲和溶质，积累数它可影响渗透调节。

换句话说，对液泡中主要渗透物质钾的积累来讲，脯氨酸起细胞质渗透调节平衡作用。

Barderska〔1993〕认为，脯氨酸可能在防止酶蛋白脱水和渗透胁迫方面起一定的作用，因而把它看做对植物有利的反应，有人还提出把它作为作物抗旱育种的指标，但是后来倾向认为，这是植物受到胁迫损害的一种症兆，而且Bawa和Sen〔1993〕指出，有些能很好适应水分胁迫的植物并不总是积累大量的脯氨酸。

有研究表明，脯氨酸可作为脱水胁迫、高温胁迫时各种酶的保护剂，脯氨酸很可能起保护膜不受高温破坏的作用。

已发现花粉中富含游离的脯氨酸。

花粉从基质中大量摄取脯氨酸，而脯氨酸含量的增加可以改善其热胁迫下的活力。

近年来的大量研究表明，脯氨酸和甘氨酞甜菜碱能起到细胞的热保护剂作用。

缺水能引起这些代谢产物积累，热胁迫对它们积累是否有显著作用还不确定。

Chu等(1974〕的研究表明，只有在缺水的条件下，高温才导致大麦积累脯氨酸，在组织水势不降低的条件下，热胁迫不能引起脯氨酸积累，不管脯氨酸是否能因热胁迫而积累，而它却在受旱胁迫时大量积累，这就涉与到大田环境中的热胁迫，因为干旱和炎热往往同时发生。

脯氨酸是在盐胁迫条件下易积累的一种氨基酸，也是盐生植物的一个非常重要的调节渗透压物质。

大麦叶片积累脯氨酸含量与外界环境中Na+的浓度成线性关系，有些植物脯氨酸是Na+胁迫的专一性反应。

如在NaCl介质中生长的鹰嘴豆耐NaCl品种，其体内积累的脯氨酸含量比敏感品种要高。

而在KCI的介质中，其体内脯氨酸的含量下降.
X正斌等，《作物杂志》1997年第4期
[2]游离脯氨酸的积累是植物对水分胁迫的一种普遍反应，无论是土壤干旱还是盐溶液引起的水分胁迫，都会使植物体内游离脯氨酸含量明显增高。

在渗透胁迫条件下，小麦胚芽鞘中游离脯氨酸在抗旱性强的品种中积累较少，在抗旱性弱的品种中积累多。

土壤干旱使脯氨酸增加的原因可能与蛋白酶活性、蛋白质的合成以与脯氨酸脱氢酶活性受到影响有关。

土壤干旱也往往引起小麦叶片总的可溶性蛋白质含量下降，但在本试验条件下发现可溶性蛋白质含量下降程度与品种抗旱性强弱没有表现出一致的趋势，这可能是由于试验材料受到渗透胁迫的时间不够。

渗透胁迫也引起SOD超氧化物酶和CAT过氧化物酶活性不同程度下降，但对于上述生理生化变化是否可作为植物抗旱性的指标目前仍有争议.。

本研究发现，在萌发期小麦渗透(0.975 Mpa)胁迫下，胚芽鞘脯氨酸以与其它生理生化指标相对含量与目前已广泛应用的抗旱指标(抗旱指数和抗旱系数)进行了相关性分析，结果表明部分指标与抗旱指数存在显著相关性，如胚芽鞘脯氨酸含量、CAT活性、SOD活性等，所以这些指标可以用来对小麦的抗旱性进行初步鉴定。

X玉梅，林琪，姜雯，X延胜，李忠渗透胁迫条件下不同抗
旱性小麦品种萌发期生理生化指标的变化[期刊论文] 麦类作物学2006,26(6)：125～130
[3]自1954年发现了黑麦牧草在水分胁迫下叶片累积脯氨酸现象以来，很多研究表明，逆境条件下脯氨酸大量累积能够增强抗逆性，并且阐明了脯氨酸累积的途径和可能的生理作用。

如在植物细胞适应胁迫过程中作为渗透调节物质、氮素储藏物质、防止大分子化合物变性、降低由胁迫引起的细胞内酸度、作为呼吸作用的底物、维持膜稳定性和保护植物免受自由基伤害等。

植物体内脯氨酸合成主要通过两条途径：谷氨酸途径和鸟氨酸途径，两条代谢途径中的关键酶分别是吡咯啉一5一羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸转氨酶(OAT)。

脯氨酸降解中的关键酶是脯氨酸脱氢酶(PDH)。

其中，PDH和OAT定位在线粒体上，P5CS主要存在于细胞质基质中。

关于游离脯氨酸累积与植物抗性关系的研究结果也不尽一致，一部分报道认为脯氨酸累积是积极主动的适应性反应，与抗性有关。

另外一种观点认为脯氨酸累积是胁迫反应，与抗性无关。

本试验研究表明，脯氨酸累积既有积极一面，又有消极一面。

结合不同浓度硝酸钾处理以与相关胁迫指标来看，PEG胁迫下 2 mmol/L的硝酸钾促进脯氨酸累积是积极的适应性反应，因为此时的丙二醛含量和细胞膜相对透性显著低于单纯PEG胁迫。

但是相对较高浓度的硝酸钾处理，10 mmol·L-1的硝酸钾显著增加脯氨酸含量，这种增加可能是消极的，表现在丙二醛含量和细胞膜相对透性都大于单纯PEG胁迫处理，说明这个浓度下脯氨酸的累积属于胁迫反应。

结合脯氨酸代谢途径中的关键酶活性变化规律，可以看出高浓度硝酸钾处理显著抑制了脯氨酸脱氢酶PDH活性，造成了游离脯氨酸大量累积。

曹芳，魏永胜渗透胁迫下硝酸钾对烟草脯氨酸代谢途径的影响 [期刊论文]--《西北农业学报》 2010，19(9)：144—148
三、实验目的与要求：
1、学习脯氨酸含量测定方法；
2、研究盐胁迫等逆境对植物体内脯氨酸含量的影响。

四、实验条件：
1、实验试剂：
3%磺基水杨酸，甲苯，冰醋酸，酸性茚三酮试剂〔25g茚三酮溶于60ml冰醋酸和40ml 6mol/L磷酸中,加热〔70℃〕溶解。

常温保存期24h，冰箱中保存48h〕，标准脯氨酸溶液〔10mg脯氨酸溶于100ml80％乙醇中，浓度为100ug/ml〕；
2、实验仪器：
天平，研钵，移液管，水浴锅，离心机，试管，722型分光光度计；
3、实验材料：
小麦、水稻。

五、实验原理与方法：
胁迫条件下植物体内脯氨酸大量积累，而且胁迫时间越长,积累的脯氨酸越多；因此植物体内的脯氨酸含量在一定程度上反映了植物受胁迫影响的程度，可作为植物对逆境响应的一个参考指标。

在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应，生成红色化合物，此产物在520nm波长下具有最大吸收峰，可用分光光度计测定，此法具有专一性。

在pH1-7时用人造沸石可以除去一些干扰的氨基酸。

六、实验步骤：
1、准备实验材料
提前一周培养小麦、水稻，并根据实验目的对其分组处理，以备后用。

小麦种子黑暗中25℃下用蒸馏水浸泡6h,使其充分吸涨，播于铺有湿滤纸的培养皿中于暗室中培养。

露白后与尼龙网架上用水培养24h。

将小麦、水稻各分为3组，分别用0.2、0.4、0.6mo l∕L的NaCl溶液培养3~4天，取地上部分做实验材料。

2、制作标准曲线
100ug/ml脯氨酸配置成0、1、2、3、4、5μg/ml一系列浓度的标准溶液。

取标准溶液各2ml，加入2ml3%磺基水杨酸、１ml 冰醋酸和3ml茚三酮试剂于加塞试管中，充分混匀后在沸水浴中加热显色40min，冷却后加入４ml甲苯盖好盖子充分震荡，待其静置分层后，吸取红色甲苯相，于波长520nm测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸浓度〔μg/ml 〕为横坐标绘制标准曲线。

3、NaCl胁迫对小麦脯氨酸含量的影响
分别取对照和NaCl处理的小麦幼苗的地上部分〔芽鞘和叶子〕0.3g，用3%磺基水杨酸5ml研磨提取，匀浆移至试管中，在沸水浴中提取10分钟，加入0.5g人造沸石充分震荡，冷却后转
移至离心管中，3000r/min离心10min，取上清液待测。

各取对照和NaCl处理的提取上清液2ml，分别加入2ml蒸馏水，１ml冰醋酸和3ml2.5 %酸性茚三酮试剂，与上述制作标准曲线一样进行显色，萃取和比色，最后从标准曲线中查得脯氨酸含量。

按照公式计算,植物体内脯氨酸含量〔ug/g〕=4A×2.5/0.3,其中Ａ为查表所得的脯氨酸。

七、实验数据的处理：
脯氨酸标准曲线为：y=0.0375x+0.0211；
因此：
小麦：实验组1：当y=0.375时，A=x=9.44ug/ml
实验组2：当y=0.833.时，A=x=21.65ug/ml
实验组3：当y= 0.843时，A=x=21.91ug/ml 水稻：实验组1：当y=0.155时，A=x=3.57ug/ml
实验组2：当y=0.194时，A=x=4.61ug/ml
实验组3：当y=0.390时，A=x=9.83ug/ml
八、实验结果与分析
不同盐浓度下，脯氨酸积累量不同，浓度越高其脯氨酸积累量越高。

小麦较水稻而言其脯氨酸含量随盐浓度改变变化更大，说明小麦比水稻受盐胁迫的影响程度更大，此植物对盐的抗逆性较差。

在处理实验组前也可明显发现小麦萎蔫程度较水稻更明显。

九、实验小结：
1、配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现用现
配；
2、在提取过程中提取、反应要充分；
3、离心前必须平衡，外管壁要干燥，离心机要水平放置等待
离心机完全停止后再取出试管；
4、甲苯有毒，需格外小心，注意教室通风；
5、使用分光光度计时，先调好波长，使用比色皿时只能拿粗
糙面，使用前必须润洗。