小球藻Chlorella sp. MEM25的分离鉴定及耐受性试验
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标识码( ＯＳＩＤ)
ＬＵ Ｘｉａｎｇｎｉｎｇ １ ꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉｎｇ １ ꎬ ＬＵ Ｙａｎｄｕ ２
(１.Ｆｕｑｉｎｇ Ｋｉｎｇｄｎａｒｍｓａ Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ Ｃｏ. ＬＴＤꎬ Ｆｕｚｈｏｕꎬ Ｆｕｊｉａｎꎬ ３５０３００ꎻ ２.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ
Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｉｋｏｕꎬ Ｈａｉｎａｎꎬ ５７０２２８)
７.０ ％组的 Ｆｖ / Ｆｍ.
１.４.２ 光照对藻种生长的影响 将培养一段时间后的 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ 离心收集ꎬ取藻泥接种于无菌 Ｆ２
液体培养基ꎬ置于温度 ２５ ℃ 、每天光照时间为 ２４ ｈ、光强分别为 ５０ 和 ２００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 的培养箱中培
养ꎬ于 ２、４、６、８ ｄ 测定各试验组的 Ｄ ７５０ ｎｍ ꎻ于 ０、１、３、６、１２、２４、４８、９６ ｈ 测定 ２００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 组的 Ｆｖ / Ｆｍ.
ｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ １２.６５×１０７ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍＬ －１ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｄａｉｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｗａｓ ３.３１×１０７ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍＬ －１
ｉｎ ｏｕｔｄｏｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅ. Ｔｏｔａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ＭＥＭ２５ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ４９.５％ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｍａｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ＭＥＭ２５ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ｖｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙ￣
ｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ. Ａｎｄ ＩＭＥＴ１ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ＭＥＭ２５. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
１０.６ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｖａｌｕｅｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｒｅａｃｈｅｄ １.８８ ｇＬ －１
ａｎｄ ５３％ ｄｕｒｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｏｕｔｄｏｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎꎬ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ２.５８ ａｎｄ １.６６ ｔｉｍｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＩＭＥＴ１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｍａｘｉ￣
收稿日期:２０２０－０９－２７ 修回日期:２０２０－１１－０６
基金项目:自然资源部十三五海洋经济产业创新项目( ＨＨＣＬ２０１８０３) .
作者简介:卢香凝(１９９４－) ꎬ女.研究方向:微藻规模养殖与应用.Ｅｍａｉｌ:ｘｉａｎｇｎｉｎｇｌｕ＠ ｆｏｘｍａｉｌ.ｃｏｍ.通信作者路延笃( １９８２－) ꎬ男ꎬ教授ꎬ博士.研
福建农林大学学报( 自然科学版)
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ( Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ)
第 ５０ 卷 第 ４ 期
２０２１ 年 ７ 月
小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５ 的分离鉴定及
耐受性试验
进行测序ꎬ将测序后获得的 １８Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列提交 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库进行多重序列比对ꎬ与 ＮＣＢＩ 上已有
的序列进行相似性比较分析ꎬ从而确定该藻株的种属.
１.４ 藻种的耐受性试验
１.４.１ 盐度对藻种生长的影响 将培养一段时间后的 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ 离心收集ꎬ取藻泥分别接种于盐
特征ꎻ挑取纯化后的藻种群落ꎬ置于 Ｆ２ 液体培养基中培养 ２ 周ꎬ取藻液观察形态学特征.
１.３ 藻种的同源性分析
参照 Ｇａｎ ｅｔ ａｌ [１５] 方法提取 ＭＥＭ２５ 的基因组 ＤＮＡ 并进行 １８Ｓ ｒＲＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增ꎬ取 ２ μＬ ＰＣＲ 产物
经质量分数为 １％的琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ余液置于 ４ ℃ 保存ꎬ之后送至上海生工生物工程股份有限公司
Ｃ１８ ∶ ３ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ３４.７％ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｈｌｏｒｅｌｌａꎻ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇꎻ ｔｏｌｅｒａｎｃｅꎻ ｏｕｔｄｏｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
小球藻是绿藻门 Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、小球藻属 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ 中的一种单细胞藻类ꎬ细胞直径约 ３ ~ ８ μｍꎬ需要在
１.６ 藻种的户外养殖
将小球藻 ＭＥＭ２５ 接种于体积为 ５００ Ｌ 的管道式户外光生物反应器ꎬ初始接种密度为 ０.５ × １０ ７ 个
５４０
福建农林大学学报( 自然科学版)
第 ５０ 卷
ｍＬ －１ ꎬ共培养 ７ ｄꎬ期间每天进行显微镜观察并做细胞计数.细胞计数方法为:藻细胞密度( 个ｍＬ －１ ) ＝ Ｎ / ５
采用梯度稀释法对藻种进行分离ꎬ将采集的盐卤水样品取 １５ ｍＬ 进行离心收集ꎬ去掉上清液ꎬ取底层
５０ μＬ 样品涂布于固体 Ｆ２ 培养基ꎬ在 ２５ ℃ 条件下培养 ２ 周后挑取绿色克隆ꎬ将其划线接种于 Ｆ２ 平板倒置
培养 ３ 周ꎬ重复 ３ 次获得纯化后的 ＭＥＭ２５.在 Ｆ２ 固体培养基上纯化获得 ＭＥＭ２５ 后ꎬ直接观察该藻的群落
养试验中 ＭＥＭ２５ 的最高浓度为 １２.６５×１０７ 个ｍＬ －１ ꎬ最大日增长量为 ３.３１×１０７ 个ｍＬ －１ ꎬ细胞中 ８ 种必需氨基酸含量占
总氨基酸含量的 ４９.５％ꎬ必需脂肪酸 Ｃ１８ ∶ ３ 占总脂含量的 ３４.７％.
关键词: 小球藻ꎻ 筛选ꎻ 耐受性ꎻ 户外养殖
中图分类号: Ｓ９１７.１
物种和重要的突变体ꎻ在规模养殖过程中出现细菌和真菌感染ꎬ会由于菌落数过高而大大降低产品质量ꎬ
甚至使产品不达标 [１３] .研究表明 [１４] ꎬ通过提高培养基盐度可以在一定程度上减少污染ꎬ然而对于相当一部
分微藻而言ꎬ盐度的提高往往导致生长速率的下降.因此筛选并鉴定出对温度、光照和盐度具有宽幅适应
范围且适应于生产应用的微藻种质资源ꎬ是实现微藻产业化过程中最基础也是最重要的一个环节ꎬ对于推
卢香凝１ ꎬ 郑 行１ ꎬ 路延笃２ Nhomakorabea(１.福清市新大泽螺旋藻有限公司ꎬ福建 福州 ３５０３００ꎻ２.海南大学海洋学院ꎬ海南 海口 ５７０２２８)
摘要: 从盐卤水样品中分离出一株藻种 ＭＥＭ２５ꎬ经形态学检验和分子生物学鉴定为小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ..以 ＩＭＥＴ１ 作为对照
组对 ＭＥＭ２５ 进行耐受性试验ꎬ 结果表明ꎬ在不同盐度、光照、温度条件下 ＭＥＭ２５ 的 Ｄ７５０ ｎｍ 和 Ｆｖ / Ｆｍ 均高于 ＩＭＥＴ１.当试验
显微镜下才能分辨 [１] .它的光合效率高、固定碳氮能力强、代谢途径丰富ꎬ富含蛋白质、脂肪、多糖、维生素、
色素等多种生物活性物质ꎬ在食品、医药、环保、基因工程、液体燃料等领域具有很高的应用价值 [２－５] .目前ꎬ
微藻的生物质可以达到 １０ 万 ｔ 干重的年产量和超过 ３０ 亿美元的年产值ꎬ其中小球藻约占 ３０％的份额ꎬ且
究方向:微藻代谢解析、光和细胞工厂构建等.Ｅｍａｉｌ:ｙｄｌｕ＠ ｈａｉｎａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ.
第４期
卢香凝等:小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５ 的分离鉴定及耐受性试验
５３９
长条件是 ２０ ~ ２５ ℃ ꎬ然而不同地域之间具有较大的温差.相较于我国北方地区而言ꎬ在我国南方地区ꎬ如
１.４.３ 温度对藻种生长的影响 将培养一段时间后的 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ 离心收集ꎬ取藻泥接种于无菌 Ｆ２
液体培养基ꎬ置于光强 ５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ꎬ光照时间为 ２４ ｈ、温度分别为 １５、２５、２８、３５ ℃ 的光照培养箱培
养ꎬ于 ２、４、６、８ ｄ 测定各试验组的 Ｄ ７５０ ｎｍ ꎻ于 ０、１、３、６、１２、２４、４８、９６ ｈ 测定 １５、３５ ℃ 组的 Ｆｖ / Ｆｍ.
文献标识码: Ａ
文章编号:１６７１￣５４７０(２０２１)０４￣０５３８￣０７
ＤＯＩ:１０.１３３２３ / ｊ.ｃｎｋｉ.ｊ.ｆａｆｕ( ｎａｔ.ｓｃｉ.) .２０２１.０４.０１５
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃａｐａｂｉｔｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５
开放科学( 资源服务)
动微藻生物技术的理论研究和现实应用具备重要的意义.
１ 材料与方法
１.１ 试验材料
小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５ 从海南盐碱地区采集的盐卤水样品中分离获得ꎻ试验中对照组的微拟球
藻 Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｅａｎｉｃａ ＩＭＥＴ１ 取自于本实验室藻种库.
１.２ 藻种的分离纯化与形态学观察
度为 １.８ ％、３.５ ％、７.０ ％、１０.５ ％的无菌 Ｆ２ 液体培养基ꎬ置于温度 ２５ ℃ 、光强 ５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 、在光照
时间 ２４ ｈ 的培养箱中培养ꎬ于 ２、４、６、８ ｄ 测定各试验组的 Ｄ ７５０ ｎｍ ꎻ于 ０、１、３、６、１２、２４、４８、９６ ｈ 测定 １.８ ％、
１.５ 藻种的模拟户外培养
在室内模拟海南的户外环境ꎬ采用容积为 １００ ｍＬ 的立柱式光生物反应器培养 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ꎬ培养
过程中全程给予盐度为 ７.０ ％、温度为 ３０ ~ ３４ ℃ 、光照为 ２５０ ~ ３５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 的条件.１０ ｄ 后收集藻
样本ꎬ参照 Ｗｕ ｅｔ ａｌ [１６] 的方法测定细胞干重和蛋白质含量ꎬ按照 Ｘｉｎ ｅｔ ａｌ [１７] 方法测定脂肪酸.
呈逐年上涨的趋势 [６] .由此可见ꎬ小球藻的规模生产和产业开发具有十分广阔的前景和市场.然而在当前
的微藻规模化养殖过程中存在着一些亟待解决的问题ꎬ比如藻种耐受能力差、易产生杂藻污染、细胞浓度
低、产量不稳定等 [７－１０] .
微藻的规模化养殖主要受生产地的环境条件影响ꎬ影响因子主要包括(１) 温度:大多数微藻的最佳生
海南岛的年均气温在 ２２ ~ ２７ ℃ ꎬ夏季最高温时可达 ４０ ℃ ꎬ过高的温度会使微藻减产ꎬ严重时会导致绝
收 [１１] .(２) 光照:光强是制约光合作用效率最关键的环境因子.在当前常见的规模养殖微藻种类中ꎬ如微拟
球藻的最适光照强度为 ５０ ~ １００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ꎬ但是我国南方地区的太阳高度角较大ꎬ获得的太阳辐射
条件分别为盐度 ７.０ ％、光照 ２５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 、温度 ３５ ℃ 条件时ꎬＭＥＭ２５ 的 Ｄ７５０ ｎｍ 分别为初始浓度的 １２.２、５.２、１０.６ 倍.
在模拟户外条件培养试验中 ＭＥＭ２５ 的干重为 １.８８ ｇＬ －１ ꎬ 蛋白质含量为 ５３％ꎬ分别是 ＩＭＥＴ１ 的 ２.５８ 和 １.６６ 倍.在户外培
较高ꎬ夏季的平均光照强度达 ５００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ꎬ远远超过了光合作用可利用的水平ꎬ过量的光照会对
微藻的光系统造成伤害ꎬ抑制光合作用ꎬ降低光合效率 [１２] .(３) 污染:微藻在培养过程中出现微生物污染是
当前急需解决的重要问题之一ꎬ比如在试验室条件下出现细菌或真菌污染会危及藻种的保藏ꎬ特别是稀有
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｄ７５０ ｎｍ ａｎｄ Ｆｖ / Ｆｍ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＩＭＥＴ１ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｌｉｎｉｔｉｅｓꎬ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ. Ｕｎｄｅｒ ７.０ ％ ｓａｌｉｎｉｔｙꎬ ２５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３５ ℃ ꎬ ｔｈｅ Ｄ７５０ ｎｍ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｗｅｒｅ １２.２ꎬ ５.２ ａｎｄ
ＬＵ Ｘｉａｎｇｎｉｎｇ １ ꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉｎｇ １ ꎬ ＬＵ Ｙａｎｄｕ ２
(１.Ｆｕｑｉｎｇ Ｋｉｎｇｄｎａｒｍｓａ Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ Ｃｏ. ＬＴＤꎬ Ｆｕｚｈｏｕꎬ Ｆｕｊｉａｎꎬ ３５０３００ꎻ ２.Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ
Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｉｋｏｕꎬ Ｈａｉｎａｎꎬ ５７０２２８)
７.０ ％组的 Ｆｖ / Ｆｍ.
１.４.２ 光照对藻种生长的影响 将培养一段时间后的 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ 离心收集ꎬ取藻泥接种于无菌 Ｆ２
液体培养基ꎬ置于温度 ２５ ℃ 、每天光照时间为 ２４ ｈ、光强分别为 ５０ 和 ２００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 的培养箱中培
养ꎬ于 ２、４、６、８ ｄ 测定各试验组的 Ｄ ７５０ ｎｍ ꎻ于 ０、１、３、６、１２、２４、４８、９６ ｈ 测定 ２００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 组的 Ｆｖ / Ｆｍ.
ｍｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ １２.６５×１０７ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍＬ －１ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｄａｉｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｗａｓ ３.３１×１０７ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍＬ －１
ｉｎ ｏｕｔｄｏｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅ. Ｔｏｔａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ＭＥＭ２５ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ４９.５％ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｍａｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ＭＥＭ２５ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ｖｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙ￣
ｓｉｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ. Ａｎｄ ＩＭＥＴ１ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ＭＥＭ２５. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
１０.６ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｖａｌｕｅｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｒｅａｃｈｅｄ １.８８ ｇＬ －１
ａｎｄ ５３％ ｄｕｒｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｏｕｔｄｏｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎꎬ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ２.５８ ａｎｄ １.６６ ｔｉｍｅｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＩＭＥＴ１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｍａｘｉ￣
收稿日期:２０２０－０９－２７ 修回日期:２０２０－１１－０６
基金项目:自然资源部十三五海洋经济产业创新项目( ＨＨＣＬ２０１８０３) .
作者简介:卢香凝(１９９４－) ꎬ女.研究方向:微藻规模养殖与应用.Ｅｍａｉｌ:ｘｉａｎｇｎｉｎｇｌｕ＠ ｆｏｘｍａｉｌ.ｃｏｍ.通信作者路延笃( １９８２－) ꎬ男ꎬ教授ꎬ博士.研
福建农林大学学报( 自然科学版)
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ( Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ)
第 ５０ 卷 第 ４ 期
２０２１ 年 ７ 月
小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５ 的分离鉴定及
耐受性试验
进行测序ꎬ将测序后获得的 １８Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列提交 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库进行多重序列比对ꎬ与 ＮＣＢＩ 上已有
的序列进行相似性比较分析ꎬ从而确定该藻株的种属.
１.４ 藻种的耐受性试验
１.４.１ 盐度对藻种生长的影响 将培养一段时间后的 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ 离心收集ꎬ取藻泥分别接种于盐
特征ꎻ挑取纯化后的藻种群落ꎬ置于 Ｆ２ 液体培养基中培养 ２ 周ꎬ取藻液观察形态学特征.
１.３ 藻种的同源性分析
参照 Ｇａｎ ｅｔ ａｌ [１５] 方法提取 ＭＥＭ２５ 的基因组 ＤＮＡ 并进行 １８Ｓ ｒＲＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增ꎬ取 ２ μＬ ＰＣＲ 产物
经质量分数为 １％的琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ余液置于 ４ ℃ 保存ꎬ之后送至上海生工生物工程股份有限公司
Ｃ１８ ∶ ３ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ３４.７％ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｈｌｏｒｅｌｌａꎻ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇꎻ ｔｏｌｅｒａｎｃｅꎻ ｏｕｔｄｏｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ
小球藻是绿藻门 Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、小球藻属 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ 中的一种单细胞藻类ꎬ细胞直径约 ３ ~ ８ μｍꎬ需要在
１.６ 藻种的户外养殖
将小球藻 ＭＥＭ２５ 接种于体积为 ５００ Ｌ 的管道式户外光生物反应器ꎬ初始接种密度为 ０.５ × １０ ７ 个
５４０
福建农林大学学报( 自然科学版)
第 ５０ 卷
ｍＬ －１ ꎬ共培养 ７ ｄꎬ期间每天进行显微镜观察并做细胞计数.细胞计数方法为:藻细胞密度( 个ｍＬ －１ ) ＝ Ｎ / ５
采用梯度稀释法对藻种进行分离ꎬ将采集的盐卤水样品取 １５ ｍＬ 进行离心收集ꎬ去掉上清液ꎬ取底层
５０ μＬ 样品涂布于固体 Ｆ２ 培养基ꎬ在 ２５ ℃ 条件下培养 ２ 周后挑取绿色克隆ꎬ将其划线接种于 Ｆ２ 平板倒置
培养 ３ 周ꎬ重复 ３ 次获得纯化后的 ＭＥＭ２５.在 Ｆ２ 固体培养基上纯化获得 ＭＥＭ２５ 后ꎬ直接观察该藻的群落
养试验中 ＭＥＭ２５ 的最高浓度为 １２.６５×１０７ 个ｍＬ －１ ꎬ最大日增长量为 ３.３１×１０７ 个ｍＬ －１ ꎬ细胞中 ８ 种必需氨基酸含量占
总氨基酸含量的 ４９.５％ꎬ必需脂肪酸 Ｃ１８ ∶ ３ 占总脂含量的 ３４.７％.
关键词: 小球藻ꎻ 筛选ꎻ 耐受性ꎻ 户外养殖
中图分类号: Ｓ９１７.１
物种和重要的突变体ꎻ在规模养殖过程中出现细菌和真菌感染ꎬ会由于菌落数过高而大大降低产品质量ꎬ
甚至使产品不达标 [１３] .研究表明 [１４] ꎬ通过提高培养基盐度可以在一定程度上减少污染ꎬ然而对于相当一部
分微藻而言ꎬ盐度的提高往往导致生长速率的下降.因此筛选并鉴定出对温度、光照和盐度具有宽幅适应
范围且适应于生产应用的微藻种质资源ꎬ是实现微藻产业化过程中最基础也是最重要的一个环节ꎬ对于推
卢香凝１ ꎬ 郑 行１ ꎬ 路延笃２ Nhomakorabea(１.福清市新大泽螺旋藻有限公司ꎬ福建 福州 ３５０３００ꎻ２.海南大学海洋学院ꎬ海南 海口 ５７０２２８)
摘要: 从盐卤水样品中分离出一株藻种 ＭＥＭ２５ꎬ经形态学检验和分子生物学鉴定为小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ..以 ＩＭＥＴ１ 作为对照
组对 ＭＥＭ２５ 进行耐受性试验ꎬ 结果表明ꎬ在不同盐度、光照、温度条件下 ＭＥＭ２５ 的 Ｄ７５０ ｎｍ 和 Ｆｖ / Ｆｍ 均高于 ＩＭＥＴ１.当试验
显微镜下才能分辨 [１] .它的光合效率高、固定碳氮能力强、代谢途径丰富ꎬ富含蛋白质、脂肪、多糖、维生素、
色素等多种生物活性物质ꎬ在食品、医药、环保、基因工程、液体燃料等领域具有很高的应用价值 [２－５] .目前ꎬ
微藻的生物质可以达到 １０ 万 ｔ 干重的年产量和超过 ３０ 亿美元的年产值ꎬ其中小球藻约占 ３０％的份额ꎬ且
究方向:微藻代谢解析、光和细胞工厂构建等.Ｅｍａｉｌ:ｙｄｌｕ＠ ｈａｉｎａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ.
第４期
卢香凝等:小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５ 的分离鉴定及耐受性试验
５３９
长条件是 ２０ ~ ２５ ℃ ꎬ然而不同地域之间具有较大的温差.相较于我国北方地区而言ꎬ在我国南方地区ꎬ如
１.４.３ 温度对藻种生长的影响 将培养一段时间后的 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ 离心收集ꎬ取藻泥接种于无菌 Ｆ２
液体培养基ꎬ置于光强 ５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ꎬ光照时间为 ２４ ｈ、温度分别为 １５、２５、２８、３５ ℃ 的光照培养箱培
养ꎬ于 ２、４、６、８ ｄ 测定各试验组的 Ｄ ７５０ ｎｍ ꎻ于 ０、１、３、６、１２、２４、４８、９６ ｈ 测定 １５、３５ ℃ 组的 Ｆｖ / Ｆｍ.
文献标识码: Ａ
文章编号:１６７１￣５４７０(２０２１)０４￣０５３８￣０７
ＤＯＩ:１０.１３３２３ / ｊ.ｃｎｋｉ.ｊ.ｆａｆｕ( ｎａｔ.ｓｃｉ.) .２０２１.０４.０１５
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃａｐａｂｉｔｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５
开放科学( 资源服务)
动微藻生物技术的理论研究和现实应用具备重要的意义.
１ 材料与方法
１.１ 试验材料
小球藻 Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ. ＭＥＭ２５ 从海南盐碱地区采集的盐卤水样品中分离获得ꎻ试验中对照组的微拟球
藻 Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｅａｎｉｃａ ＩＭＥＴ１ 取自于本实验室藻种库.
１.２ 藻种的分离纯化与形态学观察
度为 １.８ ％、３.５ ％、７.０ ％、１０.５ ％的无菌 Ｆ２ 液体培养基ꎬ置于温度 ２５ ℃ 、光强 ５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 、在光照
时间 ２４ ｈ 的培养箱中培养ꎬ于 ２、４、６、８ ｄ 测定各试验组的 Ｄ ７５０ ｎｍ ꎻ于 ０、１、３、６、１２、２４、４８、９６ ｈ 测定 １.８ ％、
１.５ 藻种的模拟户外培养
在室内模拟海南的户外环境ꎬ采用容积为 １００ ｍＬ 的立柱式光生物反应器培养 ＭＥＭ２５ 和 ＩＭＥＴ１ꎬ培养
过程中全程给予盐度为 ７.０ ％、温度为 ３０ ~ ３４ ℃ 、光照为 ２５０ ~ ３５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 的条件.１０ ｄ 后收集藻
样本ꎬ参照 Ｗｕ ｅｔ ａｌ [１６] 的方法测定细胞干重和蛋白质含量ꎬ按照 Ｘｉｎ ｅｔ ａｌ [１７] 方法测定脂肪酸.
呈逐年上涨的趋势 [６] .由此可见ꎬ小球藻的规模生产和产业开发具有十分广阔的前景和市场.然而在当前
的微藻规模化养殖过程中存在着一些亟待解决的问题ꎬ比如藻种耐受能力差、易产生杂藻污染、细胞浓度
低、产量不稳定等 [７－１０] .
微藻的规模化养殖主要受生产地的环境条件影响ꎬ影响因子主要包括(１) 温度:大多数微藻的最佳生
海南岛的年均气温在 ２２ ~ ２７ ℃ ꎬ夏季最高温时可达 ４０ ℃ ꎬ过高的温度会使微藻减产ꎬ严重时会导致绝
收 [１１] .(２) 光照:光强是制约光合作用效率最关键的环境因子.在当前常见的规模养殖微藻种类中ꎬ如微拟
球藻的最适光照强度为 ５０ ~ １００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ꎬ但是我国南方地区的太阳高度角较大ꎬ获得的太阳辐射
条件分别为盐度 ７.０ ％、光照 ２５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ 、温度 ３５ ℃ 条件时ꎬＭＥＭ２５ 的 Ｄ７５０ ｎｍ 分别为初始浓度的 １２.２、５.２、１０.６ 倍.
在模拟户外条件培养试验中 ＭＥＭ２５ 的干重为 １.８８ ｇＬ －１ ꎬ 蛋白质含量为 ５３％ꎬ分别是 ＩＭＥＴ１ 的 ２.５８ 和 １.６６ 倍.在户外培
较高ꎬ夏季的平均光照强度达 ５００ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ꎬ远远超过了光合作用可利用的水平ꎬ过量的光照会对
微藻的光系统造成伤害ꎬ抑制光合作用ꎬ降低光合效率 [１２] .(３) 污染:微藻在培养过程中出现微生物污染是
当前急需解决的重要问题之一ꎬ比如在试验室条件下出现细菌或真菌污染会危及藻种的保藏ꎬ特别是稀有
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｄ７５０ ｎｍ ａｎｄ Ｆｖ / Ｆｍ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＩＭＥＴ１ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓａｌｉｎｉｔｉｅｓꎬ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ. Ｕｎｄｅｒ ７.０ ％ ｓａｌｉｎｉｔｙꎬ ２５０ μｍｏｌｍ －２ ｓ －１ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３５ ℃ ꎬ ｔｈｅ Ｄ７５０ ｎｍ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ＭＥＭ２５ ｗｅｒｅ １２.２ꎬ ５.２ ａｎｄ