伏牛白山羊6个微卫星标记的遗传多样性分析

伏牛白山羊6个微卫星标记的遗传多样性分析
张娜娜;王清义;毛薇;王玉琴;王占彬;张小辉;白俊艳
【摘要】选取位于绵羊第6号染色体上与牛多胎基因FecB紧密连锁的2个微卫星基因座OarAE1 01、BM1329,牛第3号染色体上的微卫星基因座BMS1248,绵羊第4号染色体上的2个微卫星基因座MAF70、OarHH35及牛第8号染色体上的微卫星基因座BM1227,对伏牛白山羊遗传多样性进行检测.结果表明,6个微卫星基因座在伏牛白山羊中共检测到50个等位基因,其中平均多态信息含量(PIC)为0.789,且每个微卫星基因座的PIC>0.5,平均有效等位基因数(Ne)、平均杂合度(H)分别为5.165、0.903.由此表明,6个微卫星标记均具有高度多态性,可用于伏牛白山羊遗传多样性的分析.
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2010(000)002
【总页数】6页(P92-96,107)
【关键词】伏牛白山羊;遗传多态性;微卫星标记
【作者】张娜娜;王清义;毛薇;王玉琴;王占彬;张小辉;白俊艳
【作者单位】河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;郑州铁路职业技术学院,河南,郑州,450052;郑州铁路职业技术学院,河南,郑州,450052;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,动物科技学院,河南,洛阳,471003
【正文语种】中文
【中图分类】S827
伏牛白山羊是河南省地方优良品种,主要分布在河南省西部和西南部的伏牛山区。

伏牛白山羊具有产肉性能好、屠宰率高、繁殖性能好、耐粗饲、抗病力强、适宜山地放牧等优点。

微卫星又称简单重复序列,具有丰富的多态性、易于检测、保守性较高、显性遗传等优点,已应用于构建物种的遗传连锁图、基因鉴定、物种演化和群体间遗传分化研究等方面[1]。

相关研究内容在猪、牛、鸡等畜禽中均得到广泛应用。

张英杰等[2]、郭小雅等[3]、杨国锋等[4]、王建民等[5]就微卫星标记在不同山羊品种中的遗传多样性进行了研究,而对伏牛白山羊的研究尚未见相关报道。

因此,选取6个微卫星基因座对伏牛白山羊遗传多样性进行检测,以期为进一步研究伏牛白山羊的生产性状和繁殖性状提供理论依据。

1 材料和方法
1.1 供试材料
1.1.1 试验样本在伏牛白山羊主产区,采用颈静脉采血法随机采集90个健康个体的伏牛白山羊血样,每个个体采集10mL,加入抗凝剂抗凝,-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 主要试剂丙烯酰胺、Tris饱和酚、TEMED(上海捷瑞生物工程有限公司)Taq DNA聚合酶、dNTP、蛋白酶K(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪凝胶成像仪及分析系统(美国Alpha公司)。

1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取采用常规酚-氯仿抽提法[6],略有改动。

1.2.2 引物的设计选取6个微卫星基因座,引物序列见表1。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 6个微卫星基因座的引物序列、退火温度、登录号及来源基因座名称引物(5′→3′) 退火温度/℃ 登录号来源OarAE101 上游:T TCTT ATAGATGCACTCAAGCT AGG 63 L13692 绵羊下游:T AAGAAA TAT AT TTGAAAAAACTGTA TCT CCC BM1329 上游:T TGT T TAGGCAAGT CCAAAGTC 63 G18422 牛下游:AACACCGCAGCT TCAT CC BMS1248 上游:TG TAGCCT TT TGTGCCGAA T 54 G18644 牛下
游:AAGACACACTCACCAACATGAGA M AF70 上游:CACGGAG TCACAAAGAFRCAFACC 58 M77199 绵羊下游:GCAGGACTCT ACGGGGCCT TTGC OarHH35 上游:AAT TGCAT TCAGT ATCTT TAACA TCTGGC 63 L12554 绵羊下游:ATGAAAA TAT AAAG AGAA TGAACCACACGG BM1227 上
游:CACCAGTGA TAT TGGCT TATGG 57.8 G18418 牛下
游:GGAAGAAACACTTCCAAACCC
1.2.3 PCR反应条件 PCR反应体系总体积为20.0μL,其中ddH2O 14.0μL,10
×Buffer2.0μL,Mg2+(25mmol/L)1.0μL,DNA 模板1.0 μL,上、下游引物各
0.7μL(10pmol/μL),dNTP 0.3μL,Taq酶0.3μL。

PCR扩增反应程序:95℃预变性3min;94℃变性30s,X℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min;4℃保存。

1.2.4 扩增产物的检测及电泳分型采用10%非变性丙烯酰胺凝胶电泳,银染后用凝胶成像系统拍照保存并分析。

检测等位基因片段大小,以大小不同的等位基因按从小到大的顺序分别用英文字母(A、B、C、D、E)表示,分析各微卫星座位全部个体的基因型。

1.3 统计分析
通过软件POPGEN(Version1.32)分析每个位点的等位基因频率、多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)、杂合度(h)。

计算公式:
①多态信息含量(PIC)
pi和pj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率,m为等位基因数。

②有效等位基因数(Ne)
式中:Ne为有效等位基因数,pi为第i个有效等位基因频率。

③杂合度(h)和平均杂合度(H)
式中,h为各标记位点的杂合度,m为位点数,pi为第m个位点第i个等位基因的频率,r为位点个数。

2 结果与分析
2.1 微卫星基因座的等位基因频率、基因型频率
表2表明,伏牛白山羊的6个微卫星基因座都具有多态性,可以用来分析群体的遗传多样性。

表2 6个微卫星基因座的等位基因频率及基因型频率OarAE101 A:106 B:110 C:115 D:120 E:123 F:145 G:147 BM1329 A:145 B:147 C:150 D:155 E:160 F:170 G:175 H:180 I:190 BMS1248 A:95 B:100 C:105 D:115 E:123 F:125 G:130 MAF70 A:155 B:160 C:162 D:165 E:170 F:180 G:186 H:190 I:192
J:20112 6024 2032 222 254 1824 2612 8614 424 1020 52261 822 1812 366 1038 2284
0.0700 .3490 .1400 .1160 .1860 .0120 .1280 .0120 .3290 .1100 .1460 .1590 . 0730 .0490 .0370 .0850 .0290 .1760 .0740 .1470 .3820 .0150 .0440 .1330 .12 50 .1020 .0680 .2050 .0340 .0570 .2160 .1250 .0450 .023 AA:106/106 DD:120/120 BB:110/110 BD:110/120 AB:106/110 BE:110/123 CE:115/123
CC:115/115 EG:123/147 CG:115/147 EE:123/123 EF:123/145 BB:147/147 CC:150/150 CI:150/180 BE:147/160 CG:150/175 BF:147/170 DD:155/155 DF:155/170 BH:147/180 BD:147/155 DE:155/160 AD:145/155 DG:155/175 EH:160/180 BG:147/175 CE:150/160 DD:115/115 EE:123/123 DE:115/123 AG:95/130 BB:100/100 BC:100/105 HH:135/135 BH:100/135 CD:105/115 FG:125/130 EH:123/135 DH:165/190 BF:160/180 A A:155/155 DG:165/186 BG:160/186 DJ:165/201 EJ:170/192 AG:155/186 DI:165/192 AE:155/170 AF:155/180 FF:180/180 FG:180/186 CH:162/190 BH:160/190 CG:162/186 AD:155/165 AI:155/192 EI:170/192 DD:165/165 AB:155/160441 612 412 212 102228261 66826464224414208486624241 42410 122264222242822222
0.0470 .0470 .1860 .1400 .0470 .1400 .0230 .0700 .1400 .1160 .0230 .0230 . 0980 .0240 .0730 .1950 .0730 .0980 .0240 .0730 .0490 .0730 .0490 .0240 .02 40 .0490 .0490 .0240 .0590 .2940 .1180 .0590 .1180 .0890 .0890 .0280 .0590 .0280 .0590 .1590 .0230 .0450 .1140 .1360 .0230 .0230 .0680 .0450 .0230 .0 230 .0230 .0230 .0450 .0230 .0910 .0230 .0230 .0230 .0230 .023
续表2 6个微卫星基因座的等位基因频率及基因型频率基因座名称等位基因/bp 等位基因样本数/个等位基因频率基因型基因型样本数/个基因型频率OarHH35 A:100 B:110 C:123 D:135 E:147 F:155 G:160 BM1227 A:144 B:147 D:155 E:165 F:175 G:180 H:189 I:198 J:21016 1844 348 3216 1832 414 3022 2810 140 .0950 .1070 .2620 .2020 .0480 .1900 .0950 .1050 .1860 .0230 .0810 .174 0 .1280 .1630 .0580 .081 BF:110/155 DF:135/155 DD:135/135 BC:110/123 GG:160/160 BD:110/135 CE:123/147 EG:147/160 AD:100/135 CF:123/155 EG:147/160 CC:123/123 BB:110/110 AF:100/155 CD:123/135 DG:135/160
HI:189/198 HH:189/189 AH:144/189 AG:144/180 GG:180/180 II:198/198 DI:155/198 BB:147/147 BH:147/198 BG:147/180 DG:155/180 JJ:210/210 EJ:135/210 EF:165/175 BF:147/175 FJ:175/210 FH:175/189 AF:144/175 AB:144/147 AA:144/144 EG:165/180 FF:175/1754 1048226281 066282446284228822448624222220 .0480 .1190 .0480 .0950 .0240 .0240 . 0710 .0240 .0950 .1190 .0710 .0710 .0240 .0950 .0240 .0480 .0470 .0700 .02 30 .0930 .0470 .0230 .0230 .0930 .0930 .0230 .0230 .0470 .0470 .0930 .0700 .0230 .0470 .0230 .0230 .0230 .0230 .023
由表2可见,在每个基因座中均检测到纯合基因型。

在OarAE101中检测到12种基因型,纯合型BB110/110bp有16个个体,BD型110/120bp、BE型
110/123bp、EG型123/147bp共检测出36个个体,CE型 115/123bp、EE型123/123bp、EF型123/145(2)bp均只有 2个个体,含量极少。

在BM1329中检测到16种基因型,BE型147/160bp为16个体。

在BMS1248中检测到11种基因型,纯合型EE123/123bp具有20个个体,BH型 100/135bp、FG型
125/130bp在样本中含量极少。

在MAF70中检测到21种基因型,DH型
165/190bp、DG型165/186bp、BG型160/186bp的个体数均在10个以上。

在OarHH35中检测到 16种基因型,DF型135/155bp、CF型 123/155bp的均有10个个体。

在BM1227中检测到22种基因型,AG型144/180bp、BB型147/147bp、BH 型 147/198bp、EF 型 165/175bp 分别有8个个体。

由表2可以看出,等位基因变异范围,在OarAE101基因座上为106/147bp,在BM1329基因座上为145/190bp,在BM1248基因座上为95/135bp,在MAF70基因座上为155/201bp,在OarHH35基因座上为100/160bp、在BM1227基因座上为144/210bp。

2.2 微卫星基因座的 PIC、Ne、h、基因纯合率
用聚类分析软件分析每个微卫星基因座的PIC、Ne、h 、基因纯合率,见表 3。

由表3可以看出,6个微卫星基因座的PIC均大于0.5,MAF70最高达到0.843,说明这6个标记位点在伏牛白山羊中具有高度多态性。

Ne在群体中分布越均匀,也就越接近检测的等位基因绝对数,有效等位基因数从2.681到7.353。

h从0.854到
0.936,其中BM1227最高,达到0.939。

6个微卫星基因座OarAE101、BM1329、BMS1248、MAF70、OarHH35、BM1227的基因纯合率分别为0.372、0.146 、0.559 、0.045 、0.167 、0.326 。

表3 6个微卫星基因座在伏牛白山羊中的基因纯合率、PIC、Ne和 h基因座名称
基因纯合率 PIC Ne h OarAE101 0.372 0.762 4.739 0.880 BM1329 0.146
0.796 5.435 0.909 BMS1248 0.559 0.747 2.681 0.854 M AF70 0.045 0.843 7.042 0.918 OarHH35 0.167 0.799 5.618 0.920 BM1227 0.326 0.849 7.353 0.939
3 讨论
微卫星标记的遗传方式与普通的基因一样遵循特定的遗传规律,而且通常与质量性
状位点(ETL)或数量性状位点(QTL)相连锁[7]。

根据微卫星选择标准,每个微卫星基
因座至少应有4个等位基因方能较好地用于遗传多样性评估,不同品种在同一微卫
星座位上等位基因数目和频率的差异体现出其遗传上的差异[8]。

本次研究的6个
微卫星在伏牛白山羊上共检测到50个等位基因,平均为8.33个,说明这6个微卫星座位在伏牛白山羊中表现为多态性。

李天俊等[9]、储明星等[10]采用微卫星
BM1329、OarAE101研究在不同绵羊品种遗传多样性,发现等位基因片段大小与
此次试验的结果不符,李天俊检测出的BM1329为88/92bp、OarAE101为
63/65 bp,储明星检测到的BM1329为107/113bp、OarAE101为146/161bp。

这些结果上的差异,可能与品种、样本数、Marker或凝胶分析系统等因素有关。

目前衡量群体遗传结构和反映各基因座遗传变异程度的参数有h、PIC和Ne[11]。

PIC最初用于连锁分析时对标记基因多态性的估算,现在常用来表示位点多态性高
低的程度。

Botstein等[12]提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标来
描述微卫星位点的变异程度,当PIC＞0.5时,为高度多态性位点;0.25＜PIC＜0.5时,属中度多态性位点;当PIC＜0.25时,则为低度多态位点。

本试验中的6个微卫星座位的PIC＞0.5,表明6个微卫星座位在伏牛白山羊中多态性丰富。

黄生强等[13]在
湘东黑山羊BM1329微卫星标记的遗传多态性研究中发现,BM1329在湘东黑山羊中的PIC为0.809,说明在湘东黑山羊中多态性非常丰富。

一般认为,h是度量群体遗传变异的一个最适参数,h越高,表明群体的遗传多样性越高;h越低,表明群体的遗传一致性越高。

宋宇轩等[14]研究发现,OarAE101和
BM1329微卫星基因座杂合度在波尔山羊中高于西农莎能奶山羊。

朱广琴等[15]
通过对西农萨能奶山羊产羔数相关性研究发现,BM1329的h大于OarAE101,与此次研究结果相似。

王建民等[16]在对绵羊品种生产性状的遗传研究发现,BMS1248、MAF70的h与本试验结果近似,而BM1227的杂合度低于本试验所得结果,可能与种群差异有关。

本研究中,BMS1248、OarAE101的h分别为0.854、0.880,其余位点的杂合度均在0.900以上,且群体的平均杂合度达0.903,表明伏牛白山羊的杂
合度高,遗传变异潜力很大,因此可用于遗传多态性的评估。

Ne是衡量群体遗传变异的一个指标。

本研究的6个微卫星中,BM1227的Ne最大,而 BMS1248最小,而其余5个位点的Ne均在4.7以上,其等位基因分布不均匀可能与人工选育有关。

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