珠子参中HMGR基因对皂苷生物合成的影响

西北植物学报,２０１８,３８(４):０６２４－０６３０
A c t a
B o t ．B o r e a l ．ＧO c c i d e n t ．S i n
．
㊀㊀文章编号:１０００Ｇ４０２５(２０１８)０４Ｇ０６２４Ｇ０７㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀d o i :１０．７６０６/j
．i s s n ．１０００Ｇ４０２５．２０１８．０４．０６２４收稿日期:２０１７Ｇ１２Ｇ２３;修改稿收到日期:２０１８Ｇ０３Ｇ２３基金项目:国家自然科学基金(８１５６０６１６
)作者简介:刘美佳(１９９１－),女,在读硕士研究生,主要从事现代分子生物学及基因工程研究.E Ｇm a i l :１００３３２０１９０＠q q
．c o m ∗通信作者:葛㊀锋,博士,教授,主要从事药用植物和微生物的代谢工程研究.E Ｇm a i l :p a n a x c o r d y c e p
s ＠１６３．c o m 珠子参中HM G R 基因对皂苷生物合成的影响
刘美佳,于怡琳,姜㊀森,张㊀翔,葛㊀锋∗,刘迪秋
(昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明６５０５００
)摘㊀要:该研究以珠子参愈伤组织为材料,通过同源克隆方法获得了珠子参３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ
甲基戊二酰辅酶A 还原酶(HMG R )基因(P j HM G R ,登录号:MG ７１２２９６)的c D N A 序列,并对其进行生物信息学分析.基于P j HM G R 序列构建了珠子参过表达载体p C AM B I A ２３００s ＧP j HM G R ,通过根瘤农杆菌转化法将其转化到珠子参细胞中,成功获得７株阳性转P j HM G R 基因细胞系;通过实时荧光定量P C R ㊁比色法及皂化法等技术测定阳性细胞系P j HM G R 基因的相对表达量㊁HMG R 酶活㊁皂苷和植物甾醇含量变化.结果显示:(１)与野生型珠子参细胞系相比,转P j H ＧM G R 基因珠子参阳性细胞系中,P j HM G R 基因的相对表达量㊁HMG R 酶活和皂苷含量均有不同程度的提高;在效果最好的阳性细胞中,P j HM G R 基因的相对表达量㊁HMG R 酶活和皂苷含量分别为对照的７．１５㊁６．１４和３．５０倍.(２)在研究过程中,发现转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高.研究认为,将珠子参关键酶基因P j H ＧM G R 过表达载体导入珠子参愈伤组织细胞中,可引起相关关键酶基因相对表达量和P j
HMG R 酶活性的增加,从而调控珠子参总皂苷的合成,对皂苷合成途径中关键酶基因进行调控将可能实现对皂苷生物合成的调节.关键词:珠子参;HMG R ;皂苷;三萜;过表达中图分类号:Q ７８５;Q ７８６;Q ９４２．６
文献标志码:A
E f f e c t o f HM G R G e n e o n t h eB i o s y n t h e s i s o f S a p
o n i n s i n P a n a x j a p o n i c u s L I U M e i j i a ,Y U Y i l i n ,J I A N GS e n ,Z H A N G X i a n g ,G EF e n g ∗
,L I U D i q
i u (F a c u l t y o fL i f eS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,K u n m i n g U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,K u n m i n g ６
５０５００,C h i n a )A b s t r a c t :T h e c D N As e q u e n c e o f P j HM G R w a s c l o n e d f r o m P a n a x j a p
o n i c u s c a l l u s a n db i o i n f o r m a t i c s a Ｇn a l y s i s o f i tw a s c o n d u c t e d i n t h e s t u d y ．O v e r e x p r e s s i o nv e c t o r p C AM B I A ２３００s ＧP j HM G R w a s c o n s t r u c Ｇt e da n d t h e n t r a n s f e r r e d i n t o t h e P ．j a p o n i c u s c a l l u s t o o b t a i n t h e t r a n s g e n i c c e l l l i n e s s u c c e s s f u l l y b y t h e m e t h o do f A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s t r a n s f o r m a t i o n ．T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o f P j HM G R ,t h e e n Ｇz y m e a c t i v i t y o f P j HMG R ,t h e c o n t e n t s o f P J S a n d p h y t o s t e r o l s i n t r a n s g e n i c c e l l l i n e sw e r e d e t e r m i n e d b y
t h e f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v eP C R ,c o l o r i m e t r i cm e t h o da n ds a p
o n i f i c a t i o n ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t :(１)a l l o f t h e m i n P j
HM G R t r a n s g e n i c c e l l s a c h i e v e d e n h a n c e m e n t s t o s o m e e x t e n t c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l ．E s p e c i a l l y ,t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f P j
HM G R ,t h e e n z y m e a c t i v i t y a n dP J Sc o n t e n t o f t h eb e s t Ｇp e r f o r m i n g p o s i t i v e c e l l l i n ew e r e ７．１５t i m e s ,６．１４t i m e s a n d ３．５０t i m e s o f t h o s e i n c o n t r o l ,r e s p e c t i v e l y
．M e a n w h i l e ,t h e c o n t e n t o f p h y t o s t e r o l i n t r a n s g e n i c c e l l l i n e sw a s a l s o f o u n d t ob e e n h a n c e d ．(２)T h e s t u d y c
o n s i d e r s t h a t i f t h ek e y e n z y m e g e n e s (F o re x a m p l e :t h eo v e r Ｇe x p r e s s i n g v e c t o ro f P j
HM G R i nt h eb i o s y n t h e s i s p a t h w a y ,w a s t r a n s f o r m e d i n t o P a n a x j a p
o n i c u s c a l l u s ,w h i c hw i l l i n c r e a s e t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h ek e y e n z y m e g e n e s a n d t h e a c t i v i t y o f t h eP j HMG Re n z y m e ,t h e r e b y r e g u l a t i n g t h e s y
n t h e s i s o f t h e t o Ｇt a l s a p o n i n s o f P a n a x j a p
o n i c u s ．)t a k e p a r t i n t h e b i o s y n t h e s i s o f s a p o n i nw e r e r e g u l a t e d ．T h e r e g u l a t i o n
o f t h e s y n t h e t i c p a t h w a y o f s a p o n i nw i l l b e r e a l i z e d．
K e y w o r d s:P a n a x j a p o n i c u s;HM G R;s a p o n i n;t r i t e r p e n o i d;o v e r e x p r e s s i o n
㊀㊀珠子参(P a n a x j a p o n i c u s)为五加科(A r a l i a c eＧa e)人参属(P a n a x)植物,因根茎节间纤细,节膨大成球形念珠状而得名,其根茎入药.珠子参作为药材,始载于«滇南本草»,为历版«中国药典»收载品种.药用珠子参主产于云南,属名贵常用中药材,是彝族㊁纳西族㊁白族㊁藏族㊁僳族等少数民族的传统用药.珠子参性味苦㊁甘㊁微寒,归肝㊁肺㊁胃经,具有补肺养阴㊁祛瘀止痛㊁止血之功效,临床上应用于气阴两虚㊁烦热口渴㊁虚痨咳嗽㊁跌打损伤㊁关节疼痛㊁咳血㊁吐血㊁外伤出血等症状[１Ｇ２].
珠子参皂苷(P a n a x j a p o n i c u s s a p o n i n s)为珠子参的主要活性成分,主要由达玛烷型三萜皂苷和齐墩果烷型三萜皂苷构成.目前,已从珠子参根茎叶中分离出４０多种皂苷成分,主要包括竹节参皂苷Ⅳa㊁Ⅳ和Ⅴ,人参皂苷R０㊁R e㊁R d和R b１等[３Ｇ５].与珠子参同为人参属的人参(P a n a x g i n s e n g)主要含达玛烷型皂苷,齐墩果烷型皂苷仅发现含量极微的人参皂苷R０;而三七(P a n a xn o t o g i n s e n g)只含达玛烷型皂苷,不含齐墩果烷型皂苷[６Ｇ７].珠子参所含皂苷组分与同属人参㊁三七相比,在成分种类以及各组分含量上均存在明显差异,因其含有大量齐墩果烷型皂苷,导致临床上的用途比较特殊[８].现代药理学研究表明,珠子参皂苷具有抗炎镇痛㊁改善心肌缺血㊁增加脑血流量㊁抗肿瘤㊁免疫调节以及治疗白细胞减少症等功效[９Ｇ１０].
药用植物三萜类皂苷主要由甲羟戊酸(MV A)途径合成,因此珠子参皂苷也通过MV A途径合成[１１Ｇ１２].近年来,与珠子参亲缘关系较近的人参㊁三七皂苷合成途径研究已取得重要进展,皂苷生物合成的上游㊁中游路径基本清楚,下游的皂苷骨架后修饰过程也在逐步获得解析[１３].通过MV A途径合成珠子参皂苷的过程如下:首先,两分子乙酰辅酶A(a c e t y lＧc o A)经过硫解反应缩合生成乙酰乙酰辅酶A(a c e t o a c e t y lＧc o A),此反应需在乙酰辅酶A酰基转移酶(a c e t y lＧc o Aa c y l t r a n s f e r a s e,A A C T)的催化下完成(其中乙酰乙酰辅酶A是由一分子乙酰辅酶A脱去一个乙酰跟另一分子乙酰辅酶A乙酰基结合从而生成的物质).乙酰乙酰辅酶A在乙酰辅酶A及羟甲酰戊二酰辅酶A合成酶(３Ｇh y d r o x yＧ３Ｇm e t h y l g l u t a r y l C o As y n t h a s e,HMG S)的作用下合成３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酰辅酶A(HMGＧC o A).HMGＧC o A在关键酶３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酰辅酶A 还原酶(HMG R)的催化作用下合成了甲羟戊酸(MV A),珠子参皂苷的合成正式进入到MV A途径,HMG R也因此成为MV A途径的首个关键酶[１４].随后,经过异戊烯基焦磷酸(I P P)㊁鲨烯合成酶(S S)㊁鲨烯环氧酶(S E)和法呢基焦磷酸(F P S)等一系列催化反应,生成２,３Ｇ氧化鲨烯,它是三萜皂苷及植物甾醇等的共同前体物质.２,３Ｇ氧化鲨烯由达玛烯二醇合酶(D S)催化进入达玛烷型皂苷合成支路,同时,经由βＧ香树脂合成酶(A S)催化,进入齐墩果烷型皂苷合成支路(图１).
近年来,对于珠子参皂苷的研究多集中于有益于人类健康及疾病防治的药理学领域,而珠子参皂苷生物合成途径相关基因的调控研究较少.已有研究表明HMG R是甲羟戊酸途径的第一个关键酶,通过调控HM G R基因的表达影响盾叶薯蓣皂苷的生物合成[１５];此外,T a n s a k u l等[１６]研究表明过表达人参皂苷合成途径中关键酶基因会导致人参皂苷积累量的变化.由于珠子参与人参㊁三七同属,因此对珠子参皂苷生物合成中关键酶基因进行调控也可能会影响皂苷的合成.本研究选取珠子参皂苷生物合成途径中关键酶基因P j HM G R为研究对象,在珠子参细胞中过表达该基因,明确P j HM G R的功能及其在皂苷合成过程中的地位,为获得高效㊁稳定的珠子参皂苷合成调控技术提供理论参考和依据.１㊀材料和方法
１．１㊀实验材料
珠子参药材来源于云南省玉龙县珠子参大棚,经云南大学虞泓教授鉴定为珠子参(P a n a x j a p o n iＧc u s),本研究所用珠子参材料是本实验室诱导并培养的珠子参愈伤组织.研究所用农杆菌感受态细胞E H A１０５㊁大肠杆菌感受态细胞T r a n s１ＧT１和植物过表达载体p C A M B I A２３００s均由本实验室保存;克隆载体p G E MＧT和MＧM V L逆转录试剂盒均购买于P r o m e g a公司;S a n P r e p柱式D N A胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购于上海生工生物工程有限公司.１．２㊀方㊀法
１．２．１㊀珠子参R N A提取和c D N A第一链合成㊀采用两步法提取珠子参总R N A.首先通过改良的异硫氰酸胍法进行初提,随后通过酚和氯仿抽提以及
５２６
４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘美佳,等:珠子参中HM G R基因对皂苷生物合成的影响
HM G R．３Ｇ羟基Ｇ３Ｇ甲基戊二酰辅酶A 还原酶;F P S ．法呢基焦磷酸;S S ．鲨烯合成酶;S E ．鲨烯环氧酶;D S ．
达玛烯二醇合成酶;A S ．香树脂合成酶;C A S ．环阿屯醇合成酶;G T．葡萄糖基转移酶;P ４５０．细胞色素P ４５０
图１㊀珠子参皂苷及植物甾醇生物合成途径
HM G R．３Ｇh y d r o x y Ｇ３Ｇm e t h y l g l u t a r y l C o Ar e d u c t a s e ;F P S ．F a r n e s y l p y r o p h o s p h a t e s y n t h a s e ;A S ．A m y s y r i n s y n t h a s e ;S S ．S q u a l e n e s y n t h a s e ;S E ．S q u a l e n e e p o x i d a s e ;D S ．D a m m a r e n e d i o l ＧI I s y n t h a s e ;C A S ．C y c l o a r t e n o l s y
n t h a s e ;G T．G l u c o s y l t r a n s f e r a s e ;P ４５０．C y
t o c h r o m e sP ４５０F i g ．１㊀T h e s y n t h e s i s p a t h w a y o f P ．j a p
o n i c u s s a p o n i n s a n d p l a n t s t e r o l s D N A 酶消化处理纯化后,
获得纯度较好的珠子参总R N A [１７]
.c D N A 第一链的合成利用M ＧMV L 逆转
录试剂盒完成,将获得的c D N A 置于－２０ħ条件下保存备用.
１．２．２㊀P j HM G R 基因克隆㊀本研究首先根据N C ＧB I 公布的人参HM G R 基因(A G V ２６４４４．１)
设计特异性引物,以珠子参细胞R N A 逆转录形成的c D ＧN A 为模板进行P C R 扩增与测序,初步获得了珠子参HMG R 基因序列.以获得的珠子参HMG R 基
因序列O R F 为模板,设计特异引物P j
HM G R ＧB a m H ⅠＧF (５ᶄＧC G C G G A T C C C A C C G A A T C C T C ＧC C A C T A C Ｇ３ᶄ)和P j HM G R ＧK p
n I ＧR (５ᶄＧC G G G G ＧT A C C T G A C A T A T C C C G G C T T G A C Ｇ３ᶄ
),再次P C R 扩增及测序确认.克隆体系为:c D N A 模板
５．０μL ,１０ˑB u f f e r５．０μL ,E x t a q 酶０．５μL ,d N T P s ４．０μL ,１０μm o l /L 上下游引物０．５μL ,
N u c l e a s e Ｇf r e ew a t e r (无核酸酶的水)３４．５μL ,总体系为５０．０μL .反应程序为９５ħ预变性５m i n ;９５
ħ３０s ,５１ħ３０s ,７２ħ２m i n ,共３２个循环;
结束后７２ħ延伸７m i n .利用S a n P r e p 柱式D N A 胶回收试剂盒,对所得目的基因片段进行提取与纯化,并与克隆载体p G E M ＧT 连接,筛选阳性菌株并测序,最终获得了珠子参生物合成途径中关键酶基因
P j
HM G R 的c D N A 序列.菌液测序和引物合成均由上海生物工程技术服务有限公司完成.
１．２．３㊀P j
HM G R 基因过表达载体构建和阳性细胞系抗性初筛㊀通过B a m HI 和K p n I 限制性内切酶构建过表达重组载体p C AM B I A ２３００s ＧP j
HM G R .通过热激转化法将重组载体转入大肠杆菌D H ５α感受态细胞中,筛选阳性菌株.通过液氮冻融法将上述阳性菌种质粒转入E H A １０５农杆菌感受态细胞中,将上述农杆菌侵染普通的珠子参细胞获得
P j
HM G R 转基因珠子参阳性株系.提取生长状态良好的P j HM G R 转基因珠子参阳性系基因组D N A ,以卡那霉素抗性基因n p t Ⅱ目的条带为模板,设计特异引物n p
t ⅡＧF (５ᶄＧC T C T ＧG A T G C C G C C G T G T T Ｇ３ᶄ)和n p
t ⅡＧR (５ᶄＧC C C T ＧG A T G C T C T T C G T C C A Ｇ３ᶄ).P C R 检测体系为:
６２６西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷
D N A模板１．５μL,１０ˑ
E a s y T a q B u f f e r２．０μL, d N T P s１．５μL,D N A P o l y m e r a s e５．０μL,１０μm o l/L的上下游引物０．２μL,N u c l e a s eＧf r e ew a t e r １４．５μL,总体积为２０．０μL.P C R反应程序为９５ħ预变性５m i n;９５ħ３０s,５４ħ３０s,７２ħ２m i n,共３２个循环;结束后７２ħ延伸７m i n.P C R 反应的产物通过１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测.１．２．４㊀转基因珠子参细胞系荧光定量分析和H M G R酶活测定㊀P j HM G R基因表达水平通过荧光定量P C R检测.转基因珠子参阳性株系R N A 提取和纯化与１．２．１方法一致.荧光定量和内参的特异性引物为１８s r R N AＧF(５ᶄＧA A C C A T A A A C G A TＧG C C G A C C A GＧ３ᶄ)㊁１８s r R N AＧF(５ᶄＧT T C A G C C T TＧG C G A C C A T A C T C CＧ３ᶄ)㊁q HM G RＧF(５ᶄＧT C C A C A G CＧC T A C T G A T G A TＧ３ᶄ)和q HM G RＧR(５ᶄＧG G G C A A A CＧT A A T G A G A A A C T A CＧ３ᶄ).整个反应通过G o T a q ２ＧS t e p R TＧq P C RS y s t e m(P r o m e g a,U S A)完成,具体程序设置为９４ħ预变性３０s;９４ħ变性５s,６０ħ退火反应３０s,７２ħ延伸３０s,共４５个循环;结束后７２ħ延伸９m i n.
通过改良的紫外分光光度计法测定转基因珠子参阳性株系酶活.采用０．１m o l L－１蔗糖,０．０５m o l L－１氯化钠,０．０４m o l L－１磷酸二氢钾,０．０３m o l L－１E D T A钠盐构成的B u f f e rA和加入０．０２m o l L－１二硫苏糖醇(D T T)B u f f e rA的B u f f e rB 提取珠子参P j HMG R的可溶性微粒体蛋白.考马斯亮蓝法测定P j HMG R微粒体蛋白浓度,在３４０n m处用紫外分光光度计测定空白对照和上述转基因样品的吸光度,并根据下列公式[酶活(μm o l m g－１ m i n－１)＝(Δ３４０/m i n样品－Δ３４０/m i n空白)/１２．４４ˑVˑM]计算P j HMG R酶活.１．２．５㊀转基因珠子参细胞系皂苷和植物甾醇含量测定㊀准确称取珠子参皂苷标准品１０m g,用适量甲醇溶解.分别以吸光值㊁珠子参总皂苷含量为横纵坐标绘制珠子参皂苷标准曲线.用甲醇溶液溶解适量转基因珠子参细胞系粉末,再以超声法提取珠子参总皂苷粗提物,H P D１００大孔树脂纯化珠子参总皂苷.以香草醛Ｇ高氯酸Ｇ冰乙酸显色反应为基础,利用标准曲线测定上述转基因珠子参细胞系的总皂苷含量.
称取干燥至恒重的转基因珠子参细胞系１．０g,以石油醚作为溶剂,以氢氧化钾Ｇ乙醇溶液的皂化反应㊁正己烷萃取为基础,通过索式提取方式获取转基因珠子参阳性细胞系植物甾醇提取物.根据乙酸酐Ｇ浓硫酸显色反应测定植物甾醇含量,并以吸光值㊁植物甾醇浓度为横纵坐标绘制标准曲线.利用标准曲线计算转基因样品植物甾醇含量.１．２．６㊀统计分析㊀本实验所有数据均来源于３组独立重复实验,计算标准差平均值,进行t检验.２㊀结果与分析
２．１㊀P j HM G R转基因珠子参细胞系
本实验采用同源克隆法得到了珠子参HM G R 基因的O R F全长序列,命名为P j HM G R,提交到N C B I的G e n B a n k数据库,获得登录号为MG７１２２９６,该序列包含一个１７１６b p的开放阅读框(O R F),编码５７１个氨基酸.P j HM G R基因编码蛋白序列与人参㊁三七㊁刺五加㊁常春藤的氨基酸序列比对结果显示:P j HM G R基因编码蛋白与其他药用植物HMG R一样具有多个保守的结构域,分别为T T E G C L V A㊁G T V G G G T㊁D MAMGMＧNM㊁E M P I G Y V I P和２个K T保守结构域.以上结果表明HMG R功能结构域在进化过程中具有较高的稳定性.通过农杆菌遗传转化操作,本研究获得了７株具有抗性的转P j HM G R细胞系,并依次编号为HＧ１~HＧ７,分别提取阳性细胞系的基因组D N A,以n p t I IＧF和n p t I IＧR为特异性引物进行P C R扩增,琼脂糖凝胶电泳结果显示,所有细胞系在大约４５０b p处均有与预期大小一致的特异性条带(图２).
２．２㊀P j HM G R基因表达及H M G R活性分析以上述HＧ１~HＧ７株系的c D N A为模板进行P j HM G R基因相对表达量分析.结果显示阳性细胞系中,P j HM G R基因相对表达量与野生型相比均有不同程度提高.HＧ３和HＧ７株系P j HM G R基因相对表达量增加最多,约为野生型对照组的７．１
５
M．D L２０００;１~７．转基因珠子参细胞系;８．阴性对照;９．阳性对照图２㊀P j HM G R转基因珠子参细胞系的n p t I I
基因的P C R检测
M．D L２０００;１－７．T h e t r a n s g e n i c P．j a p o n i c u s c e l l l i n e s;
８．N e g a t i v e c o n t r o l;９．P o s i t i v e c o n t r o l
F i g．２㊀T h eP C Rd e t e c t i o no f n p t I I g e n e i n t r a n s g e n i c
P．j a p o n i c u s c e l l l i n e s o f P j HM G R
７２６
４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘美佳,等:珠子参中HM G R基因对皂苷生物合成的影响
倍,而H Ｇ５株系仅仅为对照组的１．４７倍(图３).酶活分析表明,H Ｇ１~H Ｇ７转基因珠子参阳性细胞系
HMG R 活性与野生型相比均有一定提高,并以H Ｇ３株系P j HMG R 酶活最高,约为野生型株系的６．１４倍(图４).各阳性细胞系P j HM G R 基因表达量变化趋势基本与酶活变化具有较好对应关系.２．３㊀皂苷及植物甾醇含量分析
H Ｇ１~H Ｇ７中珠子参总皂苷含量与未转基因珠
子参细胞系相比有明显提高.在整个实验组中,H Ｇ
３和H Ｇ７株系总皂苷含量约为野生型对照组的３．５
倍,也明显高于其他阳性细胞系(图５).同时,转基因珠子参阳性细胞系中植物甾醇含量与野生型相比
均有不同程度增加(图５).因此过表达P j
HM G R 不仅可以有效提高珠子参主要活性成分皂苷含量,也可以提高植物甾醇含量
.
WT．野生型珠子参细胞系;H Ｇ１~H Ｇ７．P j
HM G R 转基因珠子参细胞系.下同
图３㊀野生型和转P j
HM G R 基因珠子参细胞系的P j
HM G R 基因相对表达量WT．T h ew i l d Ｇt y p e P ．j a p
o n i c u s c e l l l i n e s ;H Ｇ１－H Ｇ７．T h e t r a n s g e n i c P ．j a p
o n i c u s c e l l s o f P j
HM G R ．T h e s a m e a s b e l o w F i g ．３㊀R e l a t i v e e x p r e s s i o no f P j
HM G R i nw i l d Ｇt y p e a n d t r a n s g e n i c P ．j a p
o n i c u s c e l l l i n e
s 图４㊀野生型和转P j
HM G R 基因珠子参细胞系的HMG R 活性
F i g ．４㊀E n z y m e a c t i v i t i e s o fHM
G Ri n t h ew i l d Ｇt y p
e a n d t h e P j HM G R t r a n s g e n i c P ．j a p
o n i c u s c e l l l i n e s ３㊀讨㊀论
人参属三大药材中,人参㊁三七备受关注且研究
颇多,珠子参虽为中国传统名贵中药,却长期缺乏系统认识和研究.近年来,越来越多研究证明珠子参具有广泛而重要的药理学活性,对此相关基础研究逐步受到重视.三萜皂苷是珠子参主要生物活性成分,因此对其生物合成途径的研究尤为重要.从我们课题组前期对三七皂苷生物合成的研究中发现,在分子水平上影响人参属三萜皂苷合成的关键因素包括关键酶基因活性和转录因子活性.
目前,珠子参关键酶基因的克隆已取得了一些
进展.H u a n g 等[１８
]首次从珠子参细胞中克隆到关
键酶基因P j A S ,该基因是控制皂苷合成流向齐墩果烷皂苷的第一个关键酶基因.此外,珠子参关键酶
基因P j D S ㊁P j S S ㊁P j
F P S 也相继被克隆[１９]
.HM G R 是植物三萜皂苷合成途径中第一个关键酶,但针对于该关键酶的研究主要集中于五加科其他物种,包
括邢朝斌等[２０
]克隆了长度为１７１３b p
㊁编码５７０个氨基酸的刺五加(A c a n t h o p
a n a xs e n t i c o s u s )HM G R 基因,与人参(P a n a x g i n s e n g )的P g
HM G R (A D １８０３４６
)图５㊀野生型和转P j
HM G R 基因珠子参细胞系的总皂苷和甾醇含量
F i g ．５㊀T h e c o n t e n t o f t o t a l s a p o n i n s a n d p h y
t o s t e r o l o f t h ew i l d Ｇt y p e a n d P j
HM G R t r a n s g e n i c P ．j a p
o n i c u s c e l l l i n e s ８２６西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷
具有９２．３％的相似性;罗红梅等[２１]克隆了长度为１７７０b p㊁编码５８９个氨基酸的人参(P a n a x g i nＧs e n g)HM G R２(J X６４８３９０)基因,与西洋参(P a n a x q u i n q u e f o l i u s)的P q HM G R(A C V６５０３６)具有９９％的相似性.我们课题组曾经从三七(P a n a xn o t o gＧi n s e n g)中克隆到编码５７４个氨基酸的P n HM G R (K J５７８７５７)基因,其与人参P g HM G R(A D I８０３４６．１)序列具有９７％的相似性.本研究成功克隆了长度约为１７１６b p,编码５７１个氨基酸的珠子参P j HＧM G R(MG７１２２９６)序列,与张萍等[２２]克隆P nＧHM G R(K J５７８７５７)具有９７％的相似性,该结果表明本实验克隆的HM G R基因的完整性和准确性相对较高.
调控珠子参皂苷含量策略主要从两个层面展开.一是细胞水平上调控,即对珠子参植株进行寒冷㊁干旱等胁迫,使皂苷含量增加,该方法操作层面粗放,效果一般,难以实现对皂苷合成的稳定调控,只能影响 量 的变化而不能从根本上解决 质 的问题[２３].二是从分子水平,即通过直接控制皂苷合成的关键酶基因以及相关转录因子基因的表达影响皂苷合成,进而形成定向㊁高效㊁可靠的皂苷合成调控手段.分子操作是控制皂苷合成的终极途径.本研究通过过表达珠子参HM G R基因直接促进珠子参皂苷的生物合成,提高皂苷含量.HMG R是植物萜类合成途径中的第一个关键酶,它不仅是MV A途径的第一个限速酶,也是三萜化合物合成的重要调控点[２４].国内外对HM G R基因的功能性研究已经取得了一些进展.将人参关键酶基因P g HM G R过表达载体转化到人参发根中,可引起人参皂苷含量的增加,该转基因人参发根中皂苷含量与野生型相比平均提高了２倍以上[２５].此外,将人参关键酶基因P g HM G R１过表达载体转化到拟南芥中,同样可提高拟南芥中皂苷的积累量[２６].在青蒿素合成研究方面,HM G R能够限制黄花蒿中青蒿素的生物合成,过表达HM G R基因可增加青蒿素的含量[２７].刺五加的各个器官均可表达HM G R,增加刺五加细胞中HM G R基因的表达量可以促进刺五加总皂苷的合成[２８].前期研究表明,在三七细胞中同时过表达P n HM G R与P n S S,三七皂苷的生物合成能力可提高约４倍,相对于仅过表达１个关键酶基因来说同时过表达２个关键酶基因对皂苷合成的影响确实明显[２９].本研究还发现,皂苷合成被促进的同时,植物甾醇合成也被促进,其原因在于P j HMG R 是三萜合成途径中比较上游的关键酶,植物甾醇与三萜皂苷的合成共享上游和中游路径,因此P j HＧM G R的表达增加,提高了整个代谢流的流量,流向三萜皂苷合成支路的代谢流增加的同时,植物甾醇合成支路的流量也随之增加,最终导致珠子参皂苷和植物甾醇的合成同时获得促进.
本研究实现了P j HM G R在珠子参细胞中的过表达,提高了珠子参皂苷的积累量,证明了P j HＧMG R确实是珠子参皂苷生物合成途径中能够显著影响三萜皂苷以及植物甾醇的合成的关键酶.接下来,将重点研究关键酶基因与重要转录因子的相互作用,力图把关键酶调控层面与转录因子调控层面结合起来,构建更为高效㊁科学的皂苷调控手段,全方位㊁多角度解析珠子参皂苷的合成机制.
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(编辑:宋亚珍)㊀㊀
０３６西㊀北㊀植㊀物㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３８卷。