高三生物一轮复习 第2讲 微生物的培养与应用讲义 新人教版选修1

第2讲微生物的培养与应用
考点一| 微生物的实验室培养
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

(2)营养构成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。

此外还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。

(3)①种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。

②下表为某微生物培养基的成分
该培养基中可以为微生物提供碳源的是葡萄糖，
加入了琼脂。

2．无菌技术
(1)关键：防止外来杂菌的入侵。

(2)不同对象的无菌操作方法(连线)：
【答案】①—b—Ⅰ②—b—Ⅱ③、④—a ⑤—a—Ⅲ、Ⅳ⑥—b
3．大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
―→―→―→―→
(2)纯化大肠杆菌的方法
①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。

②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。

③接种方法：下图甲可表示用平板划线法接种获得的平板；下图乙可表示用稀释涂布平板法接种获得的平板。

④纯化原理：上图甲菌体的分散是通过一系列的连续划线操作实现的；上图乙菌体的分散是通过一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现的。

4．菌种的保存方法
(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

1．培养基
(1)培养基的成分
(1)平板划线法：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。

在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。

(如下图)
几种划线方法示意图
(2)稀释涂布平板法：10倍系列稀释操作。

①将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。

②进行梯度稀释时，从菌液开始，每次从前一试管中取1 mL 溶液注入到下一试管中混匀。

③进行涂布平板操作。

视角 1 考查微生物的纯化培养
1．(2017·陕西师范附中模拟)工厂废水的妥善处理是减轻现代化工业水污染的重要举措。

如图所示为筛选某种高效分解化工厂污水中有机化合物A的菌种的实验流程。

请分析回答下列问题：
(1)图中所配制的培养基应以____________为唯一碳源，该培养基在功能上属于____________培养基。

(2)实验过程中，“振荡”的目的是______________________，由此推断该目的菌的呼吸类型与乳酸菌的呼吸类型____________(填“不同”或“相同”)。

(3)转为固体培养基时，常采用平板划线法或____________进行接种，两种方法在此过程中所用的接种工具分别是____________和____________，操作时对接种工具采用的灭菌方法是____________灭菌。

【解析】 (1)分析实验可知，实验需要筛选某种高效分解某化工厂的污水中有机化合物A的菌种，因此图中所配制的培养基应以有机化合物A为唯一碳源，分离出能分解化合物A 的微生物；这种培养基从功能上分属于选择培养基。

(2)实验过程中，“振荡”的目的是提高培养液中的溶解氧，由此可以判断该种微生物进行的有氧呼吸，而乳酸菌只能进行无氧呼吸。

(3)转为固体培养基时，常采用平板划线法或稀释涂布平板法进行接种，两种方法在此过程中所用的接种工具分别是接种环和涂布器，操作时对接种工具采用的灭菌方法是灼烧灭菌。

【答案】 (1)有机化合物A 选择 (2)提高培养液中的溶解氧(合理即可) 不同 (3)稀释涂布平板法接种环涂布器灼烧
视角 2 综合考查微生物的培养与应用
2．(2017·泰安市二模)回答有关微生物的培养与应用问题：
(1)微生物的培养需要使用培养基，不同培养基的配方不同，但一般都具有水、无机盐、碳源、____________；在配制从土壤中筛选纤维素分解菌的培养基时，需加入____________作为唯一的碳源，该培养基属于____________培养基。

(2)若将样品接种到鉴别纤维素分解菌的培养基上，在该培养基中需要加入的特殊染料是____________，通过观察是否产生____________来筛选纤维素分解菌。

(3)若要统计土壤样品中纤维素分解菌的数目，宜采用____________法接种，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目就能大约推测出样品中的活菌数。

一同学在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为24.6，则每毫升样品中的活菌数是(所用稀释液的体积为0.2 mL)____________。

(4)纤维素分解菌产生的纤维素酶能将纤维素分解为____________，为微生物生长提供营养，人们利用其将秸秆等废弃物通过发酵生产____________等为人类利用。

【解析】 (1)微生物的营养物质主要有碳源、氮源、水和无机盐等。

筛选纤维素分解菌时，配置培养基时需要使用纤维素作为唯一的碳源的选择培养基。

(2)鉴别纤维素分解菌时需要加入刚果红染液，当形成菌落以后可以根据菌落周围是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(3)稀释涂布平板法可以用来进行微生物的计数，其原理是根据土壤样品的稀释倍数、接种稀释液的体积和统计平板上的菌落数目测算出样品中的活菌数。

根据题意可知，每毫升样品中的活菌数是23.4÷0.2×104＝1.17×106。

(4)纤维素分解菌产生的纤维素酶能将纤维
素分解为葡萄糖，为微生物生长提供营养，人们利用其将秸秆等废弃物通过发酵生产酒精等为人类利用。

【答案】 (1)氮源 纤维素 选择 (2)刚果红 透明圈 (3)稀释涂布平板 1.17×106 (4)葡萄糖 酒精
两种纯化细菌方法的比较
考点二| 微生物的分离与计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理
土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

(2)统计菌落数目
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

(3)实验流程
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

2．分解纤维素的微生物的分离
(1)纤维素酶
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C 1酶、C X 酶和葡萄糖苷酶。

②作用：
纤维素C1酶纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖
(2)纤维素分解菌的筛选
①原理
纤维素分解菌
↓
纤维素刚果红―→红色复合物纤维素酶――→红色消失，出现透明圈。

②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

④实验流程
：富含纤维素的环境
↓
：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度
↓
：制备系列稀释液
↓
：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
：透明圈的菌落
1．菌株筛选原理的比较
(1)显微镜直接计数法
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。

③缺点：不能区分死菌与活菌。

(2)间接计数法(活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

3．设置对照
(1)目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)方法：①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。

②证明选择培养基的筛选作用，用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。

1．为了使结果接近真实值，应设置三个或三个以上的平板，计算出菌落平均数。

2．计算时明显偏离实际值(本组实验其他平板计数值)的要舍弃后求平均值。

3．对照实验的设计首先要明确设计的目的，分析出实验的自变量之后才能准确设计。

视角 1 微生物的筛选方法
1．(2017·青岛市一模)在调查和分离湖水中耐盐细菌的实验中，先将10升湖水水样浓缩至10毫升，然后各取浓缩水样1毫升，涂布到多个培养皿中培养。

请回答：
(1)可以通过提高培养基中____________的浓度，筛选被调查细菌，这种培养基被称为____________培养基。

(2)要提高实验结果的可靠性，排除培养基未彻底灭菌的可能性，应该设置的对照组是____________。

为检验(1)中筛选方法的效果，可以设置的对照组是____________。

(3)在微生物的培养过程中，实验室对培养基灭菌常用的方法是____________。

为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿____________培养。

在培养基上产生的单个菌落在生态学中可以被称为____________。

(4)根据培养皿上菌落的平均数可以计算湖水中该种细菌的密度，但计算的数据要比实际活菌的数目少，原因是
______________________________________________________________
______________________________________________________________。

【解析】 (1)此实验的目的是调查和分离湖水中耐盐细菌，因此可通过提高培养基中NaCl的浓度，从而筛选出被调查细菌，而其他耐盐性较低或不耐盐的细菌则被杀死，这种培养基被称为选择培养基。

(2)要提高实验结果的可靠性，排除培养基未彻底灭菌的可能性，应该设置一个未接种的培养皿作为对照组。

(1)中筛选耐盐细菌是通过加入高浓度的NaCl实现的，因此要检验(1)中筛选方法的效果，可以设置的对照组是未加高浓度的NaCl培养基进行培养。

(3)对培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌。

微生物极有可能进入培养皿中附在冷凝水中，为防止冷凝水影响细菌的生长，需将培养皿倒置培养。

在培养基上产生的单个菌落为同一种生物的总和，在生态学中可以被称为种群。

(4)观察培养皿上菌落数时，若两个或多个细胞连在一起时，视为一个菌落，则计算的数据要比实际活菌的数目少。

【答案】 (1)盐(或NaCl) 选择 (2)未接种(或接种等量无菌水)的培养皿未加高浓度盐的培养基培养 (3)高压蒸汽灭菌倒置种群 (4)当两个或多个细胞连在一起时在平板上观察到的是一个菌落
视角 2 微生物的培养和应用
2．(2015·全国卷Ⅰ)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。

脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。

回答有关问题：
(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用________染色。

微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。

(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。

(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用________法进行计数。

(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，________℃条件下该酶活力最小。

为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________℃设计后续实验。

【解析】 (1)油脂可被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，被苏丹Ⅳ染液染成红色，因此油脂通常用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色。

不易挥发的物质大多采用萃取法进行提取，水蒸气蒸馏法一般用来提取易挥发的物质。

(2)能产生脂肪酶的微生物B能利用脂肪(油脂)作为碳源，所以在制备选择微生物B的培养基时，应将油脂作为唯一的碳源。

(3)用显微镜直接对微生物进行计数，需要用血细胞计数板。

如果对活菌进行计数，则要用稀释涂布平板法涂布平板，培养后统计菌落数目，然后计算出活菌数量。

(4)降解等量的油脂，需要的酶量越多，说明此温度下的酶的活力越小。

所以三种温度中45 ℃下酶的活力最小。

从三种温度下的实验结果可知，40 ℃下酶的活力最大，所以要想测定该酶的最适温度，应围绕该温度设计不同温度梯度，进行后续实验。

【答案】 (1)苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ) 萃取法 (2)油脂 (3)血细胞计数板稀释涂布平板(4)45 40
真题验收| 感悟高考淬炼考能
1．(2016·全国乙卷)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。

某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。

实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________。

若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。

若将30(即36—6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。

【解析】 (1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。

若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。

(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。

(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。

空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均数。

【答案】 (1)牛肉膏、蛋白胨琼脂 (2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
(3)污染不正确
2．(2016·全国丙卷)某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。

分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。

回答下列问题：
(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是______________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________。

(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有________和________。

分离纯化时应挑选出________的菌落作为候选菌。

(3)乳酸菌在－20 ℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。

【解析】 (1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。

(2)乳
酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢(无氧呼吸)过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。

(3)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3 mL的甘油瓶中，装入1 mL甘油后灭菌。

将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。

【答案】 (1)无菌水泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落 (2)鉴别乳酸菌中和产生的乳酸(或酸) 具有透明圈 (3)甘油
3．(2014·全国卷Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。

回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。

(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。

用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。

(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_______________________________；
培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________________________________________________。

【解析】 (1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。

(2)刚果红是一种染料，可以与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(3)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，而用于分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，并且培养基中需含有纤维素，才能与CR形成红色复合物，有纤维素分解菌时才能形成以纤维素分解菌为中心的透明圈。

【答案】 (1)纤维二糖葡萄糖 (2)红透明圈
(3)不能液体培养基不能用于分离单菌落不能培养基中没有纤维素，不会形成CR—
纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
4．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。

回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。

在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是____________；
然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。

据此可得出每升水样中的活菌数为________。

(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过______________灭菌。

在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。

这样做的目的是___________________________________________。

(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。

结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。

分析其原因是：振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。

【解析】 (1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取灭菌后的空白平板先行培养一段时间。

0.1 mL稀释液中平均有(39＋38＋37)/3＝38个活菌，则每毫升稀释液中活菌的数目为38/0.1＝380，则稀释前每毫升水样中活菌数目为380×100＝3.8×104，则每升水样中活菌数目为3.8×104×1 000＝3.8×107。

(2)接种环、接种针等金属用具可直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，以达到迅速彻底灭菌的目的。

在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。

(3)比较图A和图B可以看出：A培养基中细菌的分布呈线性，是用平板划线法接种培养后得到的结果；B培养基中细菌均匀分布，是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

(4)振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高了营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。

【答案】 (1)检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107
(2)灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
(3)B (4)溶解氧营养物质
5．(2013·全国卷Ⅱ)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。

实验时，首先要
从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。

回答下列问题：
(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用________法或________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。

(2)取该单菌落适当稀释，用________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。

(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明______________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的 ________。

(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素 ________。

【解析】 (1)实验室中对微生物纯化培养时，常用的接种方法有划线法和稀释涂布法。

(2)若让已经获得的单个菌落在固体培养基上大量且均匀繁殖，常用涂布器把稀释的菌液均匀涂满整个平板。

(3)对某种抗生素越敏感的致病菌，在该抗生素存在的范围内，越不易生存，形成的透明圈就越大。

但是，如果在透明圈中还有菌落生存，则说明这个菌落的细菌耐药性很强。

(4)通过(3)可知，在应用时，要想杀死某致病菌，就得选择能使该致病菌大量死亡，即产生的透明圈大的那种抗生素。

【答案】 (1)划线稀释涂布(或涂布) (2)涂布 (3)敏感不敏感该致病菌对C的敏感性比对A的弱耐药菌 (4)A。