实验四、氨基酸纸电泳分离鉴定

实验四、氨基酸纸电泳分离鉴定
一、目的要求通过电泳分离氨基酸，了解氨基酸的性质以及电泳分离技术的应用。

一、实验原理
带电粒子(胶体或分子)在直流电场作用下，能向异性电极迁移，这种现象称为电泳。

带电粒子之所以能在电场的作用下迁移，是因为在一定PH环境条件下，不同的物质所带的电荷种类、数量不同，在一定的电场作用下，就以不同的速度向不同的电极方向移动，从而达到分离混合物和鉴定未知物的目的。

带电粒子在电场内移动的方向及电泳速度，除取决于粒子的分子量和电荷量外，还与电场强度、溶液PH、缓冲溶液的离子强度以及电渗等因素有关。

电泳是离子在电场中通过介质的移动，按支持介质的不同可分为:(1)纸电泳:以滤纸、玻璃纤维等为支持物。

(2)凝胶电泳:以聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶等为支持物。

(3)薄膜电泳:醋酸纤维素为支持物。

氨基酸分离选用滤纸为支持介质进行电泳。

氨基酸在水溶液中通常解离成两性离子，它在酸性和碱性介质中的变化可用下式表示:
HHCHCOORRCHCOORCHCOOHOHOH
NHNH32NH3
在酸性介质中，氨基酸主要以阳离子状态存在，电泳时向阴极移动;在碱性介质中，氨基酸主要以阴离子状态存在，电泳时向阳极移动，当介质的PH值为氨基酸的等电点时，氨基酸以中性偶极离子存在，电泳时不向阴阳电极移动。

实验在pH=5.9的缓冲溶液中进行，一张被PH5.9缓冲溶液所湿润的滤纸的两端加上直流电压，在电场的作用下，加在滤纸支持介质的各种氨基酸样品，由于所带电荷性质不同，分别向正负极方向移动，电泳体系缓冲溶液偏离氨基酸的等电点
越远，氨基酸所带的电荷越多，离子移动的速度也就越快，因各氨基酸迁移的速度均不相同，从而达到分离的目的。

二、试剂及材料
1、PH5.9 0.025mol/L 邻苯二甲酸氢钾—氢氧化钠缓冲溶液称取邻苯二甲酸氢钾 5.10g，加水溶液至950mL ,用氢氧化钠调整PH=5.9，补水至1000mL 。

2、氨基酸溶液 0.5%亮氨酸、0.5%赖氨酸、0.5%天门冬氨酸。

3、氨基酸混合液。

4、氨基酸显色液 0.1%茚三酮丙酮溶液。

四、仪器设备中压电泳仪、电泳槽。

五、操作方法
1、电泳滤纸的裁剪取层析滤纸裁成250×25mm 的滤纸条，用铅笔在滤纸的中心位置标
记样品电泳时的起始位置，在滤纸的两端标上正负极符号。

如下图所示。

(+) × (-)
、向电泳槽添加适量的缓冲溶液，要求两槽缓冲液液面保持同一水平。

2
3、接上电泳仪主机，中压条件下预热10min。

关闭电泳仪电源。

4、用PH5.9缓冲液湿润滤纸条，然后用电吹风把多余的缓冲液吹干，把滤纸条按正负极方向横架于电泳槽的支位上，滤纸面尽量绷直，滤纸两端下垂紧贴在定位板，末端浸入缓冲液约10mm 深。

注意滤纸条不应接触电极，两滤纸间应保持一定间距。

5、用微量进样器吸取氨基酸样品4μl ，一次把样品点在滤纸的起始点(×)上，然后正确连接主机与电泳槽的正负极连线，盖上电泳槽盖子。

6、开启主机电源，调整电泳电压至300V，记录电泳初始电压。

注意电泳过程电流的变化，如电泳电流接近仪器的最大额定工作电流时，可把电压略调低使电流不超过20mA。

7、30min后电泳结束，记录电泳终止电压，关闭电源，迅速把滤纸条从电泳槽中取出，用电吹风挥干其缓冲溶液。

8、用喷雾器对滤纸均匀喷洒茚三酮显色剂，立即用热风吹干，在滤纸上可显示清晰的氨基酸显色斑点。

标记电泳图谱氨基酸斑点位置，分析判断为何种氨基酸。

注:在纸电泳中，由于滤纸常含有一定量的羧基而带负电荷，使与纸相接触的水溶液带正电荷，使液体向负极移动。

此时，粒子实际电泳的速度是粒子本身电泳速度与由于水溶液移动而产生电渗速度的迭加。

因此，若粒子原来向负极移动，则表面速度将比电泳速度快;若原来向正极移动，则表面速度将比电泳速度慢，所以，中
性物质有时在电场中也可能向负极移动。

六、实验结果讨论分析
要求绘出电泳谱图，分析各氨基酸向正负极移动的原理。

七、思考题
1、实验中若电泳缓冲液的PH改变为2.9，电泳图谱各氨基酸斑点的位置将发生什么变
化,
2、蛋白质A的PI=5.5，蛋白质B的PI=6.9，电泳介质PH=7.0，电泳时各蛋白向哪个
电极方向迁移,为什么,
3、记录电泳过程电参数的变化有何意义,
4、实验中哪些步骤须除去滤纸多余的缓冲液或须对滤纸进行热风干燥，其目的是什
么,。