浅谈如何实现“三旧”改造效益最大化

收稿日期：２００７－１１－２４录用日期：２００７－１２－３０
基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．５０７７８１７０）；国家高技术研究发展计划（８６３）项目（Ｎｏ．２００７ＡＡ０６Ｚ４１４）
作者简介：李剑（１９８０—），女，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎ＿ｌｉ＠ｍａｉｌｓ．ｇｕｃａｓ．ａｃ．ｃｎ；＊通讯作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ）：Ｅ－ｍａｉｌ：
ｍａｍｅｉ＠ｒｃｅｅｓ．ａｃ．ｃｎ
酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母
李剑，马梅＊，饶凯锋，王子健
中国科学院生态环境研究中心
环境水质学国家重点实验室，北京１０００８５
摘要：应用酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母，用以检测类／抗雌激素化合物和环境样品的类／抗雌激素活性．采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）法扩增人雌激素受体（ｈＥＲ）基因，构建诱饵质粒ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ；分别提取并纯化两种含有ＥＲ共激活因子基因的靶质粒ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１；诱饵质粒和靶质粒同时转染酵母细胞Ｙ１８７，于营养缺陷型培养基（ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ）上筛选阳性菌落，分别构建两种ＥＲ双杂交酵母ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１．考察双杂交酵母与不同激素：１７β－雌二醇（Ｅ２）、二氢睾酮（ＤＨＴ）、孕酮（ＰＧ）以及三碘甲状腺原氨酸（Ｔ３）的结合情况，并考察了雌激素受体拮抗剂４－羟基他莫昔芬（４－ＯＨＴ）与酵母的相互作用．结果表明：ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１酵母均能够专一性的和Ｅ２结合，并存在显著的剂量－效应关系，Ｅ２对ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１酵母β－半乳糖苷酶活性诱导的ＥＣ５０值分别为７．３×１０－１１ｍｏｌ・Ｌ－１和１．５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１，其中ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母细胞诱导产生的酶活性值明显高于ＥＲ＋ＳＲＣ１酵母细胞．４－ＯＨＴ能够抑制Ｅ２诱导ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母细胞产生的酶活性，并存在显著的剂量－效应关系，ＩＣ５０值为１．０×１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１．表明重组人雌激素受体基因酵母可以用于检测化合物和环境样品的类／抗雌激素活性．关键词：酵母双杂交；人雌激素受体；重组基因酵母；类／抗雌激素活性
文章编号：１６７３－５８９７（２００８）１－０２１－０６
中图分类号：Ｘ５２４
文献标识码：Ａ
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｔｈｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＥｓｔｒｏｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒ（ｈＥＲ）ＧｅｎｅＹｅａｓｔＵｓｉｎｇＴｗｏ－ＨｙｂｒｉｄＹｅａｓｔＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ＬＩＪｉａｎ，ＭＡＭｅｉ＊，ＲＡＯＫａｉ－ｆｅｎｇ，ＷＡＮＧＺｉ－ｊｉａｎ
ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＡｑｕａｔｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＥｃｏ－ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８５Ｒｅｃｅｉｖｅｄ２４Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００７
ａｃｃｅｐｔｅｄ３０Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ
（ｈＥＲ）ｇｅｎｅｙｅａｓｔｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＩｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｉｔｈｈＥＲａｎｔ／ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ，ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ，ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，ｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅＥＲｇｅｎｅ．Ｏｔｈｅｒｔｗｏｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１ｃｏｄｉｎｇｆｏｒＥＲｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＧＲＩＰ１，ａｎｄｐＧＡＤ４２４ＳＲＣ１ｃｏｄｉｎｇｆｏｒＳＲＣ１，ａｎｏｔｈｅｒＥＲｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ．ＴｈｅｙｅａｓｔｃｅｌｌｓＹ１８７ｗｅｒｅｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤａｎｄｐＧＡＤ４２４ＧＲＩＰ１
ｏｒｐＧＡＤ４２４ＳＲＣ１，ａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｇｒｏｗｔｈｏｎｓｙｎｔｈｅｔｉｃｄｅｘｔｒｏｓｅ
（ＳＤ）ｍｅｄｉｕｍ（ｌａｃｋｉｎｇｔｒｙｐｔｏｐｈａｎａｎｄｌｅｕｃｉｎｅ）ａｄｄｅｄａｇａｒ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｎｄＥＲ＋ＳＲＣ１ｙｅａｓｔｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｅｔｅｓｔｅｄｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｏｆｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇ１７β－ｅｓｔｒｏｇｅｎ（Ｅ２），ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＴ），ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ（ＰＧ），ａｎｄ３，３′，
５－ｔｒｉｉｏｄｏ－Ｌ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ
（Ｔ３）．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔｗｉｔｈｋｎｏｗｎＥＲａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，４－ｈｙｄｒｏｘｙｔａｍｏｘｉｆｅｎ（４－ＯＨＴ），ｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｎｄＥＲ＋ＳＲＣ１ｙｅａｓｔｈａｄｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇｗｉｔｈＥ２ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｅｎｅｙｅａｓｔｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥ２ｗａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｉｎａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｄｍａｎｎｅｒ．ＴｈｅＥＣ５０ｖａｌｕｅｓｏｆＥ２ｆｏｒＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｎｄＥＲ＋ＳＲＣ１ｙｅａｓｔｗｅｒｅ７．３×１０－１１ｍｏｌ・Ｌ－１ａｎｄ１．５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅβ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＲ＋ＳＲＣ１．Ｗｅａｌｓｏ
ｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈａｔ４－ＯＨＴｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅβ
－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥ２ｉｎａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ，ｔｅｓｔｅｄｂｙＥＲ＋ＧＲＩＰ１ｙｅａｓｔａｓｓａｙ．ＡｎｄｔｈｅＩＣ５０ｖａｌｕｅｗａｓ１．０×
１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１．ＡｌｌｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｐｐｏｒｔｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈＥＲｇｅｎｅｙｅａｓｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｓｃｒｅｅｎｃｈｅｍｉｃａｌｓａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈａｎｔ／ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｙｅａｓｔ；ｈｕｍａｎｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｅｎｅｙｅａｓｔ；ＥＲａｎｔ／ａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ
第３卷第１期
２００８年２月
生态毒理学报
ＡｓｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１
Ｆｅｂ．２００８
生态毒理学报第３卷
１引言（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）
经典的激素－受体理论认为：天然雌激素主要通过与雌激素受体中的配体结合域（ＬＢＤ）结合形成激素－受体复合物，再通过受体中的ＤＮＡ结合域（ＤＢＤ）识别并结合雌激素效应元件（ＥＲＥ），从而转录激活靶基因，发挥雌激素效应（楼丽广等，１９９７）．根据此分子作用机制已建立了环境雌激素酵母测评体系（何世华等，２００２）和重组受体基因报道基因酵母等方法（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅｅｔａｌ．，１９９６），用于检测环境内分泌干扰物通过雌激素受体介导而产生的类雌激素作用．２０世纪９０年代通过对天然雌激素受体作用机理的研究又发现了一系列雌激素受体的共激活因子（Ｃｏａｃｔｏｒ）（Ｈｏｎｇｅｔａｌ．，１９９６；Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆｅｔａｌ．，１９９５），它们不直接与ＤＮＡ结合，而是通过直接或间接与受体相互作用，促进基因转录．在此基础上形成的新的受体作用理论认为，天然雌激素与受体的ＬＢＤ结合后形成复合物并发生构象的改变，进一步结合协同激活因子，促进转录．为考察人雌激素受体ＬＢＤ表达蛋白和受体协同激活因子蛋白的相互作用，本研究基于该机制发展酵母双杂交技术，构建双杂交重组雌激素受体基因酵母．
酵母双杂交技术的基本原理是利用ＧＡＬ４蛋白的ＤＮＡ结合域序列（ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ）和ＥＲ－ＬＢＤ基因结合，构建出ＢＤ－ＥＲ－ＬＢＤ融合表达载体；同时将ＧＡＬ４蛋白转录激活结构域（ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ）和受体协同激活因子蛋白结合，构建ＡＤ－受体协同激活因子融合表达载体．将这两个表达载体共转化至酵母细胞内表达．当没有雌激素或环境雌激素存在时，ＥＲ－ＬＢＤ和受体协同激活因子蛋白无相互作用，导致ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ与ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ蛋白在空间上不能接近，报告基因不表达；当雌激素或环境雌激素存在时，该类化合物首先与雌激素受体ＬＢＤ蛋白结合形成复合物，该复合物进而结合受体协同激活因子蛋白，使得ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ与ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ在空间上接近，启动报告基因表达，通过测定报道基因ＬａｃＺ表达产物β－半乳糖苷酶活性，表征化合物的类雌激素活性．因此，基于新的受体作用理论建立的双杂交酵母系统更加接近哺乳动物内分泌系统的真实作用情况．核受体协同激活因子ＧＲＩＰ１和ＳＲＣ１是目前研究得比较多的协同激活因子，研究发现人的
雌激素受体与ＧＲＩＰ１和ＳＲＣ１可相互作用，因此，本工作同时构建了ＥＲ－ＧＲＩＰ１和ＥＲ－ＳＲＣ１两株双杂交酵母，筛选与雌激素存在较强作用的菌株，建立环境雌激素双杂交酵母筛选体系．环境内分泌干扰物在接近或低于无可见不良效应浓度水平（ＮＯＡＥＬ）时仍可诱发生物效应，是当前风险评价中的一个重大问题（卫立等，２００７），因此，建立环境内分泌干扰物快速筛选方法体系的工作，已经刻不容缓．
２材料与方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ）
２．１主要实验材料与试剂
含有人ＥＲαＬＢＤ（ａａ２８２－５９５）的ｐＡＳＶ３质粒，由英国Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ大学Ｈｅｅｒｙ教授惠赠；ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１（ａａ５－１４６２）质粒和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１（ａａ３１３－９７７）质粒由美国加州大学Ｓｔａｌｌｃｕｐ教授惠赠．感受态大肠杆菌ＤＨ５α、质粒小提试剂盒、凝胶回收质粒试剂盒、ｐＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ载体、Ｘ－ｇａｌ溶液、１ｋｂＤＮＡｍａｒｋｅｒ、ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅣ、氨苄青霉素、卡那霉素均购自Ｔｉａｎｇｅｎ生物试剂公司．ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ、Ｔａｑ酶、ＢａｍＨΙ酶和ＥｃｏＲΙ酶购自Ｔａｋａｒａ公司．Ｙ１８７酵母菌株（ＭＡＴα，ｕｒａ３－５２，ｈｉｓ３－２００，ａｄｅ２－１０１，ｔｒｐ１－９０１，ｌｅｕ２－３１１２，ｇａｌ４△，ｍｅｔ－，ｇａｌ８０△，ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１ＵＡＳ－ＧＡＬ１ＴＡＴＡ－ｌａｃＺ）、ｐＧＢＫＴ７－ＢＤ克隆载体及测序引物，ｐＣＬ１质粒、ｐＧＢＫＴ７－５３质粒、ｐＧＡＤＴ７－Ｔ质粒、ｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ质粒、酵母ＹＰＤＡ培养基、ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ培养基、ＴＥ溶液、１×ＴＥ／１×ＬｉＡｃ溶液、ＰＥＧ／ＬｉＡｃ溶液均购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司．ＤＭＳＯ、半硫酸腺苷购于Ｓｉｇｍａ公司．ＤＮＡ序列测定由北京诺赛基因组研究中心完成．
２．２ＰＣＲ扩增ＥＲＬＢＤ与序列分析
在上下游引物的５’－端分别引入ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ单一酶切位点，设计新基因序列特异性的引物，上游引物Ｐ１：５’－ＴＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡ－３’；下游引物Ｐ２：５’－ＴＡＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧ－３’以含有ＥＲＬＢＤ（ａａ２８２－５９５）的ｐＡＳＶ３质粒作为模板进行ＰＣＲ扩增．ＰＣＲ反应条件为：９４℃变性５ｍｉｎ，然后开始ＰＣＲ循环，９４℃３０ｓ，６１℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，共３０个循环，然后７２℃变性１０ｍｉｎ，反应体积为５０μＬ，扩增产物通过０．８％琼脂糖凝胶电泳分析．
"""""""
""" """
２２
李剑等：酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母第１期
２．３诱饵质粒的构建
将ＥＲＬＢＤ的ＰＣＲ产物用Ｔ４连接酶连接于Ｔ－载体，反应体系为：ＰＣＲ产物０．６ｐｍｏｌ，Ｔ－载体ＤＮＡ０．０６ｐｍｏｌ，１０×连接缓冲液５μＬ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶２μＬ（７００Ｕ），反应体积为５０μＬ，１６℃反应过夜．将１０μＬ连接产物转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒并纯化．采用ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒验证目的ＥＲＬＢＤ基因片段，并对目的基因片段进行切胶回收，连接到经相同双酶切处理切胶回收的ｐＧＢＫＴ７载体上构成诱饵质粒ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ．反应体系与Ｔ－载体的连接类似．将１０μＬ连接产物转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，卡那霉素抗性筛选阳性克隆，提取并纯化质粒ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ．诱饵质粒产物采用ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切，０．８％琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时进行序列测定，测序引物为：５’－ＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＣＴＡＡＧＡＧＴＣ－３’．
２．４靶质粒的提取纯化与鉴定
１０μＬ靶质粒ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１或ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，同时添加蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，提取质粒并纯化．０．８％琼脂糖凝胶电泳鉴定，同时进行序列测定，测序引物为ｐＧＡＤ４２４通用引物．
２．５酵母双杂交实验
挑取新鲜培养的酵母Ｙ１８７菌株单菌落，在５００ｍＬＹＰＤＡ培养基中３０℃振荡培养到对数生长期后（６００ｎｍ处的吸光度值为０．４￣０．６），１０００×ｇ离心５ｍｉｎ沉淀细胞，悬浮于无菌的ＴＥ溶液中，重复离心操作，将酵母细胞沉淀溶于２．５ｍＬ新鲜配制的无菌的１×ＴＥ／１×ＬｉＡｃ溶液中．将ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒和ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒同时转染至酵母细胞Ｙ１８７，构建ＥＲ－ＧＲＩＰ１双杂交酵母，反应体系为：０．１ｍｇ载体ＤＮＡ，０．１μｇｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒，０．１μｇｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒，０．１ｍＬ的酵母细胞悬液，０．６ｍＬ无菌的ＰＥＧ／ＬｉＡｃ溶液．２００ｒｐｍ、３０℃下孵育３０ｍｉｎ，加入７０μＬＤＭＳＯ，４２℃水浴热击１５ｍｉｎ，冰浴静置１￣２ｍｉｎ，１４，０００ｒｐｍ室温下细胞离心５ｓ，０．５ｍＬ无菌ＴＥ缓冲液重悬细胞．涂布在ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ营养缺陷型的选择性固体培养基上３０℃培养２￣４ｄ．相同的方法将ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１质粒同时转染至酵母细胞Ｙ１８７构建ＥＲ－ＳＲＣ１双杂交酵母．
２．６菌落转移滤膜分析
能够在选择性培养基上生长的克隆，采用菌落转移滤膜分析的方法进一步剔除假阳性结果．具体操作如下：灭菌的干燥滤膜１＃（Ｗｈａｔｍａｎ，英国）覆盖生长有双杂交酵母菌落（直径大于２ｍｍ）的平板上，将菌落转移到滤膜，液氮反复冻融；另取滤膜２＃浸没到含Ｘ－ｇａｌ和雌二醇的缓冲溶液中润湿，将含有菌落的滤膜１＃覆盖到润湿的滤膜２＃上，３０℃孵育直到克隆出现明显的蓝色，并对显色的克隆计数，计算转化率．选择具有蓝色的阳性克隆到ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ选择性培养基上继续培养至菌落直径大于２ｍｍ，挑取菌落接种于ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ液体培养基中，３０℃、２００ｒｐｍ振荡培养过夜．第２天部分细胞添加１５％的无菌甘油后－８０℃冷冻保存，另一部分与配体结合后检测β－半乳糖苷酶的活性．
转化率（ｃｆｕ・μｇ－１）＝
克隆数（ｃｆｕ）×总重悬体积（μＬ）
涂布体积（μＬ）×稀释因子×质粒ＤＮＡ使用量（μｇ）
（１）
２．７构建双杂交酵母质量控制
为了对双质粒同时转染酵母细胞的流程进行控制，并对合成的质粒进行鉴定，考察质粒转染酵母细胞的效率，添加平行的质控实验．阳性对照实验设置两组：第一组，采用ｐＣＬ１标准质粒（编码野生型的ＧＡＬ４蛋白，能够诱导β－半乳糖苷酶活性）转染酵母细胞，并计算转化效率．第二组采用同时转染ｐＧＢＫＴ７－５３标准质粒（编码ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ蛋白）和ｐＧＡＤＴ７－Ｔ标准质粒（编码ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＡＤ蛋白），计算转化效率；阴性对照采用ｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ标准质粒（编码ＧＡＬ４ＤＮＡ－ＢＤ和人体ｌａｍｉｎＣ杂合蛋白）和ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒或ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１质粒同时转染酵母细胞，计算转化率．
２．８β－半乳糖苷酶活性的检测
β－半乳糖苷酶活性的检测方法参照本实验室已经报道的方法（李剑等，２００６）．β－半乳糖苷酶相对酶活性Ｕ的计算公式如下：
Ｕ＝（ＡＳ－ＡＢ）／ｔ・Ｖ・Ｄ・ＯＤＳ（２）式中，Ｕ为β－半乳糖苷酶活性；ｔ为反应时间（ｍｉｎ）；
２３
生态毒理学报第３卷
Ｖ为测试体积（ｍＬ）；Ｄ为稀释因子；ＯＤＳ为测试样品５９５ｎｍ处的吸光度值；ＡＳ为测试样品在４２０ｎｍ处的吸光度值ＯＤ４２０；ＡＢ为空白对照在４２０ｎｍ处的吸光度．
３结果与分析（Ｒｅｓｕｌｔｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ）
３．１ＥＲＬＢＤ基因片段的ＰＣＲ产物电泳分析取ＰＣＲ产物１０μＬ于０．８％琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在分子量１０００ｂｐ左右出现一条带，与ＥＲＬＢＤ（ａａ２８３－５９５）基因（片段长９６３ｂｐ）大小一致，如图１．
３．２ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ诱饵质粒的构建与鉴定ＰＣＲ产物通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接到Ｔ载体上，构建Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒，经ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切鉴定（图２ａ），为约３０００ｂｐ的载体片段以及约１０００ｂｐ的插入片段，表明质粒构建正确．将ｐＧＢＫＴ７和Ｔ－ＥＲＬＢＤ质粒用ＥｃｏＲΙ和ＢａｍＨΙ双酶切，酶切产物电泳后切胶回收，ｐＧＢＫＴ７和插入片段的回收产物采用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，构建ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ诱饵质粒．ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒经酶切鉴定正确（图２ｂ），可见约７０００ｂｐ的载体片段以及约１０００ｂｐ的插入片段，同时对质粒的测序结果进一步证实上述质粒正确克隆了ＥＲＬＢＤ基因片段，插入方向及阅读框正确．
３．３靶质粒的提取纯化与鉴定
１０μＬ靶质粒ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１或ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１的ＤＮＡ纯化产物，于０．８％琼脂糖凝胶电泳．结果显示，在分子量约１０ｋｂ处各有一条带，与ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１和ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１报道的ＤＮＡ大小一致（Ｄｉｎｇｅｔａｌ．，１９９８），如图３．同时对质粒的测序结果进一步证实上述质粒基因片段，插入方向及阅读框正确．
３．４酵母双杂交实验
ｐＧＢＫＴ７－ＥＲＬＢＤ质粒分别和ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１质粒以及ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１质粒同时转化感受态酵母细胞Ｙ１８７，重悬细胞，将转化后的酵母细胞分别涂布到５块含有ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ固体培养基的平板上，计算质粒的平均转化率，如表１所示．结果表明：双杂交雌激素受体酵母以及阳性对照样品的转化率较高，均大于３．５×１０４ｃｆｕ・μｇ－１；阴性对照样品转化率为０，即选择性培养基上无克隆生长；阳性对照和阴性对照样品间存在显著性差异（ｐ＜０．０１），表明整个转化过程得到较好的控制
．２４
李剑等：酵母双杂交技术构建重组人雌激素受体基因酵母
第１期
表１不同质粒同时转化酵母细胞Ｙ１８７的转化率
Ｔａｂｌｅ１Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｆｏｒｔｈｅｙｅａｓｔｃｅｌｌｓ
３．５双杂交雌激素受体基因酵母剂量－效应关系的建立
将ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母细胞暴露到不同浓度的１７β－雌二醇（Ｅ２，Ｓｉｇｍａ，美国）溶液中，检测诱导产生的酶活性，建立了Ｅ２对酶活性诱导的剂量－效应关系曲线，如图４所示．结果表明，Ｅ２对ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母酶活性诱导均存在明显的剂量－效应关系，最大效应浓度分别为：２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１和５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１；ＥＣ５０值分别为７．３×１０－１１ｍｏｌ・Ｌ－１和１．５×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１；与国际上报道的Ｅ２在重组酵母系统中检测的ＥＣ５０结果类似（Ｒｅｈｍａｎｎｅｔａｌ．，１９９９；Ｇａｉｄｏｅｔａｌ．，１９９７），表明本实验建立的的双杂交酵母方法与报道的其它方法相比对Ｅ２具有较高的敏感度，初步表明双杂交雌激素受体基因酵母测评体系是成功的．比较两株酵母发现，ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母株具有较大的酶活性诱导值以及较小的ＥＣ５０值，表明Ｅ２依赖的ＥＲ与受体共激活因子ＧＲＩＰ１的结合能力较强，因此ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母株对Ｅ２具有更高的灵敏度．
３．６双杂交雌激素受体酵母专一性的检测将双杂交雌激素受体基因酵母，暴露到其他３
种人体激素：二氢睾酮（ＤＨＴ，Ｓｉｇｍａ，美国）、孕酮（ＰＧ，ＭＰｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，德国）和三碘甲状腺原氨酸（Ｔ３，Ｓｉｇｍａ，美国）中，通过检测其β－半乳糖苷酶活性，考察不同激素与受体的结合情况．结果表示为ＤＨＴ、ＰＧ和Ｔ３诱导酶活性与Ｅ２（２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１）诱导酶活性的相对百分比，如图５所示．在１０－１１￣１０－６ｍｏｌ・Ｌ－１浓度范围内，ＤＨＴ、ＰＧ和Ｔ３对两株雌激素受体酵母的β－半乳糖苷酶活性几乎没有诱导；而Ｅ２对酶活性存在明显诱导，与ＤＨＴ、ＰＧ和Ｔ３相比存在显著性差异（ｐ＜０．０１）．因此，Ｅ２对ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母存在专一性诱导．
３．７４－羟基他莫昔芬抑制１７β－雌二醇诱导双杂交雌激素受体基因酵母酶活性的剂量－效应关系他莫昔芬或４－羟基他莫昔芬（４－ＯＨＴ，Ｓｉｇｍａ，美国）是常用的雌激素受体拮抗剂，在研究化合物或环境样品的抗雌激素效应时，常被选为标准拮抗剂．因此，本实验选取４－ＯＨＴ，考察其对Ｅ２诱导
雌激素受体酵母阳性对照阴性对照
双杂交酵母ＥＲ＋ＧＲＩＰ１ＥＲ＋ＳＲＣ１ｐＣＬ１ｐＧＢＫＴ７－５３
＋ｐＧＡＤＴ７－Ｔ
ｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ
＋ｐＧＡＤ４２４－ＧＲＩＰ１
ｐＧＡＤＴ７－Ｌａｍ
＋ｐＧＡＤ４２４－ＳＲＣ１
转化率（１０４ｃｆｕ・μｇ－１）３．５±０．３５±０．５５±０．７４．５±０．３０．０±０．００．０±
０．０
２５
生态毒理学报第３卷
双杂交雌激素受体基因酵母酶活性的抑制效应．选取具有较高的酶活性诱导效应的ＥＲ＋ＧＲＩＰ１双杂交酵母细胞，将不同浓度的４－ＯＨＴ分别与Ｅ２（２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１）共同孵育，检测诱导酶活性．结果表示为与Ｅ２（２×１０－１０ｍｏｌ・Ｌ－１）单独诱导酶活性的相对百分比，如图６所示．结果表明，４－ＯＨＴ对Ｅ２诱导的酶活性存在明显的抑制效应；根据抑制的剂量－效应关系，４－ＯＨＴ的半数抑制效应浓度（ＩＣ５０）值为１．０×１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１．Ｚｈｏｕ等（１９９８）报道４－ＯＨＴ对Ｅ２抑制的ＩＣ５０为１．４４×１０－７ｍｏｌ・Ｌ－１，与本试验的结果类似．
以上研究结果表明，所构建的ＥＲ＋ＧＲＩＰ１和ＥＲ＋ＳＲＣ１双杂交酵母细胞均能选择性地检测雌激素物质，酶活性诱导均存在明显的剂量－效应关系，ＥＲ＋ＧＲＩＰ１酵母株对Ｅ２具有更高的灵敏度，初步结果显示上述方法能够同时应用于类／抗雌激素效应物质的筛选．
通讯作者简介：马梅（１９６７—），女，博士，中科院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室副研究员，硕士生导师，主要研究方向为水生态毒理学，已发表文章７０余篇．
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