蛋白质和多肽的氨基酸序列分析

• 1、酸性水解
• 酸性水解是采用较多的一种水解方法，其中HCl是最 通用的水解剂。 • 条件：6 mol/L HCI、真空、110℃，水解时间为20～ 24h。即可用于液相水解模式也可用于气相水解模式。 • 损失：在该条件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰 胺和谷氨酰胺分别被完全水解为天冬氨酸和谷氨酸， 色氨酸则被完全破坏，半胱氨酸不能从样品中直接测 定，酪氨酸部分被水解液中痕量杂质所破坏，丝氨酸 和苏氨酸被部分水解，损失分别为10%和5%。
• 柱后反应法
• 将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再与 显色剂(茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛)作用。
• 优点：比较稳定，对样品预处理要求低，容易定
量和自动化操作。
• 缺点：检测灵敏度不高，分析时间长(蛋白质水解
液需1 h而某些生理样品则需4 h以上)。
• 柱前衍生法
• 将氨基酸和化学偶联试剂先反应生成氨基酸的衍 生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接 检测衍生物的光吸收或荧光发射。
• 色氨酸的保护
• 水解酸中加添加剂：例如加入巯基乙酸和β-巯基乙 醇，可使色氨酸的回收可达80％。 • 有机酸：3mol／L疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在水 解时对色氨酸有一定的保护作用。 • 酶：利用蛋白酶作为水解剂，条件温和，对天冬酰 胺和谷氨酰胺及色氨酸均无破坏作用。 • 碱：用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色 氨酸不被破坏。
• 1、茚三酮反应
• α-氨基酸与水合茚三酮一起在水溶液中加热，除脯氨 酸和羟脯氨酸产生黄色物质，其它氨基酸都产生蓝紫
色物质。
• 此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅， 在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含 量。
• 2、柱后荧光胺法
荧光胺能在室温下迅速和一级胺发生反应，其 荧光产物的激发波长390 nm，发射波长475 nm。 荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应 的灵敏度大约提高了3个数量级。
• 3、酶水解
• 用一组蛋白酶水解肽链，特别适用于对化学水解敏 感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。
• 优点是水解过程中氨基酸不发生消旋化，几乎可
以保持所有的组成氨基酸不被破坏。因为酶水解条 件温和，对天冬酰胺、谷氨酰胺等皆无破坏作用。
• 缺点是反应需要较长的时间，水解的产物为较小
的肽段，水解不完全。另外，因为酶本身也是蛋白 质，对样品的测定结果可能会有干扰。
氨基酸组成分析的目的
现代分离提纯技术的发展使蛋白质操 作微量化，但也给定量带来了困难，一般 很难通过常规的称量或测蛋白溶液在 280nm的光吸收值来准确定量蛋白质，所 以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质 样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据 结果便可以推算出蛋白量的可靠值。
另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结 果的情况，一种可能是蛋白质的N端封闭，另 一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分 是非蛋白质物质，解决这个问题的很好途径便 是做一个氨基酸组成分析以确定样品的成分。 除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基 酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液 中的游离氨基酸。
总之，蛋白质水解阶段所采用的方法 不同，会对氨基酸组成分析产生重要影响。 对于不同的蛋白质、不同的研究目的、以及 样品量的多少，应采取不同的水解方法。
二、特殊氨基酸的保护
不同水解条件下，各种氨基酸的回收 有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半 胱氨酸可能遭水解破坏，导致无法正确测 定其含量。 因此水解过程中，需要考虑对特殊氨 基酸的保护。
一、蛋白质或多肽的水解方法
• 水解是蛋白质氨基酸组成分 析的第一步，作用是破坏蛋 白质的肽键，得到游离的氨 基酸，用于之后的定性定量 分析。 • 这是极其重要的一步，因为 水解质量的好坏将直接影响 到最终分析结果的正确与否。
虽然多肽的氨基酸组成分析已向更灵 敏、更精确、更快速以及自动化方向发展 和改进，但还没有一种单独适用于所有残 基的，并且能在水解液中定量回收的水解 方法出现，很多因素如温度、时间、水解 试剂、添加剂、水解方法等对水解的完全 程度均有影响。 • 下面主要对一些常用的水解方法作简要介 绍。
章节
第一节 氨基酸组成分析 第二节 蛋白质的末端测定 第三节 亚基拆离、肽链降解和肽段的分离 第四节 肽段的氨基酸顺序测定
第五节 蛋白质一级结构的重建
第一节 氨基酸组成分析
第一节 氨基酸组成分析
一、蛋白质或多肽的水解方法
二、特殊氨基酸的保护 三、衍生方法及原理 四、氨基酸定性和定量分析 五、测定氨基酸组成的实验步骤
• 3、邻苯二甲醛(OPA)法
• OPA最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐 渐应用于柱前反应中。 • OPA能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很 强荧光的异吲哚衍生物，该反应在室温下1 min即可完 成。
• 4、PTC-AA分析法
• 属柱前衍生法，源于Edman降解法测定蛋白质一级结构。 • 异硫氰酸苯酯(PITC)能在碱性条件下和氨基酸反应，生成 苯氨基硫甲酰（PTC）-AA，能在254nm检出。此法分 析灵敏度和荧光胺、OPA的荧光法相同。
氨基酸组成分析的步骤
• 目前蛋白质或多肽的氨基酸组成分析主要包括 3个步骤，即：
1 水解
在一定温度、酸 度等条件下，蛋 白质或多肽的肽 键断裂，水解成 游离氨基酸。
2 衍生
在游离氨基酸残 基上衍生一个生 色基团
3 色谱
利用高效液相色 谱对这些氨基酸 进行定性和定量 色谱分析。
• 最终获得蛋白质或多肽中各氨基酸所占摩尔百分数或 摩尔比。
• 半胱氨酸的保护：
• 还原烷化法：产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。
烷化试剂包括4-乙烯吡啶和碘代乙酸。 • 缺点：为了确保试剂接近巯基，还原和氧化通常在变 性剂存在下进行，多余试剂和变性剂要用HPLC、沉 淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的损失。
• 氧化反应：过甲酸氧化反应被用来转化半胱氨酸和
• 相关措施：
• 对某些氨基酸的破坏率，需要用不同水解时间测 定这些氨基酸的含量，然后外推到水解时间为0时， 算得的氨基酸含量，即代表了真正数值。 • 有些脂肪族氨基酸残基间的肽键，如Ile-Ile、ValVal、Ile-Val等之间的肽键难于裂解，可以通过延 长水解时间如水解92h甚至120h来解决。但是长时 间的水解，会使较敏感的氨基酸残基的损失更大。 • 半胱氨酸和甲硫氨酸往往先将蛋白质用过甲酸氧 化后再水解，相应得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。
• 5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法
• 荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能与所有 氨基酸柱前反应形成高稳定性的带有荧光的DNS氨基酸。但反应耗时。
6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法
灵敏度是Dansyl-Cl法的1/5，反应产生 有色衍生物，能方便地在254 nm和425 nm处 用紫外检测。 有报道用DABITC代替Dabsyl-Cl，反应 产生DABTH-AA，在酸性环境中显红色，易 在254 nm，269 nm，436 nm 检测。
引言
测定蛋白质的一级结构前的准备工作
1. 样品纯度必须>97%以上； 聚丙烯酰胺凝胶电泳要求一条带 2. 测定蛋白质的相对分子质量； SDS-PAGE，凝胶过滤法，沉降系数法 3. 测定蛋白质多肽链种类和数目； 种类： SDS-PAGE 数目：N末端氨基酸残基摩尔数/蛋白质摩尔数 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每 种氨基酸的个数；
1947
1955
岛素的一级结构
引言
引言
一级结构测定的基本流程
1. 拆分蛋白质分子的多肽链; 2. 鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基; 3. 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较 小的片段; 4. 对各肽段的氨基酸序列进行测序; 5. 重建完整多肽链的一级结构; 6. 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置； 7. 酰胺基位置的确定。
第十章
蛋白质和多肽的氨 基酸序列分析
引言
• 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子量在 75～200Da之间，其化学通式为：
• 在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生 物来源的多肽中出现D型氨基酸。
引言
• 蛋白质和多肽是由20种氨基酸按照一定的顺序通过肽 键连接成一长链，然后通过链内、链间的离子键、疏 水作用等多种作用力进行折叠卷曲形成一定的构象并 发挥其独特作用。氨基酸的排列顺序即蛋白质的一级 结构决定了蛋白质的高级结构及功能。 • 因此，分析蛋白质的氨基酸序列是进行蛋白质结构功 能研究中不可缺少的部分。
• 5、膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析）
如果蛋白质样品采用电泳法(如SDS-PAGE)分离， 很难从凝胶中洗脱下来，可采用电印迹法把样品转移 到PVDF (聚偏氟乙烯)膜上，然后在PVDF膜上直接进 行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位(in situ)分析。 可将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部 加入200ul含7％巯基乙酸的6mol/L盐酸，110 ℃真空水 解24 h，水解结束后用200 ul 含30％甲醇的0.1 mol/L 盐酸反复三次将氨基酸从PVDF膜中抽提出来，以便 进行下一步的分析。
• 优点：此法可检测OPA-（邻苯二甲醛），PTC-，
PTH-，DABS-，Dansyl-和DABTH-氨基酸，分析 灵敏度高，可利用HPLC进行氨基酸分析。
• 缺点：有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨
基酸检测。
• 柱后反应法 VS 柱前衍生法
• 几种常见的氨基酸分析方法：
• • • • • • 1、茚三酮反应 2、荧光胺法 3、邻苯二甲醛(OPA)法 4、PTC-AA分析法 5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法 6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法
• 光谱法：
• 分光光度法：应用较早，在蛋白质分子中，如不 含胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根 据其在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收， 测定色氨酸和酪氨酸的含量，此经验公式只适用 于色氨酸对酪氨酸的比值为0.2~1时的情况。 • 二阶微分光谱法：常被用来确定蛋白质中芳香族 氨基酸的含量，计算公式复杂，Hewlett Packard 公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件， 能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。
胱氨酸成为半胱磺酸再进行测定。 • 缺点：会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸会转变成甲 硫氨酸砜，酪氨酸会降解。必须准备能分析两次的样 品量．一次提供半胱氨酸数据，另一次则提供其他氨 基酸的组成数据。
三、衍生方法及原理
• 衍生是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的 化合物。 • 大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法 直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为 具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。 • 从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后反 应法和柱前衍生法两大类。
四、氨基酸定性和定量分析
氨基酸的定性和定量分析一般采用纸层 析、薄层层析、离子交换柱层析等方法。采 用HPLC仪和氨基酸自动分析仪更好。随着 仪器的不断改进，一个样品的测定仅需 20min即可完成。
• 2、碱性水解
• 碱性水解一般选用NaOH和KOH作为水解剂。 例如将水解样品加入5mol/L NaOH中，充氮 气后填充管，110 ℃水解22h。 • 该水解方法是HCl水解的互补法。因为碱水 解时，多数氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、精氨 酸以及半胱氨酸遭到破坏，其它的氨基酸外 消旋化，仅色氨酸是稳定的。所以此法仅限 于测定色氨酸的含量。
• 常见蛋白水解酶及其作用位点
• 4、微波辐射能水解
• 微波是一种高频电磁波，其能量传递是 通过分子的极化，而水分子的极化作用是非 常高的，微波能量的快速吸收能导致完全水 解的时间大大缩短。在微波辅助酸水解和微 波辅助酶水解中，水解时间可从过去的几十 小时缩短到几十分钟。 • 因此，微波辅助蛋白质水解技术的出现 大大提高了氨基酸组成分析的效率。
蛋白质测序的研究历史
1940年前
采用部分水解的方法试图测定 蛋白质的氨基酸序列 Consden等利用色谱技术成功测 定了短杆菌肽S6的氨基酸序列 Sanger首次测定了牛胰岛素的一级 结构（由51个氨基酸残基组成） Spackman、Stein、Moore制造了自 动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定 量分析进入了一个崭新的阶段 Edman 推出第一台自动测序仪