植物基因组DNA的提取及检测 门颖丽

学年论文
（本科）
学院生命科学
专业生物科学
年级2009级
姓名门颖丽
论文题目植物基因组DNA的提取及检测指导教师卢东升职称教授成绩
2011 年 5 月 19 日
目录
摘要 (1)
关键词 (1)
Abstract (1)
Key words (1)
0 引言 (1)
1实验材料与方法 (2)
1.1 实验材料 (2)
1.1.1 实验材料的选择 (2)
1.1.2 实验材料的保存和预处理 (2)
1.2 实验方法 (2)
1.2.1 CTAB缓冲液法 (2)
1.2.2 SDS缓冲液法 (3)
2 结果分析 (3)
2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果 (3)
2.2 紫外分光光度计检测结果 (4)
2.3 实验结果分析 (4)
3 实验讨论 (5)
3.1 酚类物质 (5)
3.2 多糖物质 (5)
参考文献： (6)
植物基因组DNA的提取及检测
学生姓名：门颖丽学号：20095071177
学院：生命科学学院专业：生物科学
指导教师：卢东升职称：教授
摘要:基因组是指细胞中的所有DNA，包括所有的基因和基因间区域。

植物除了细胞核基因组外，还有细胞质基因组，后者包括线粒体基因组和质体基因组。

特定物种的基因组，包含了该物种生长、发育以及繁殖等各项生理活动的几乎全部信息。

研究基因组DNA，要求提取的DNA要有较高的纯度和得率，以便用于PCR、RFLP分析、基因文库的构建以及基因探测等后续研究。

对近年来关于植物基因组DNA研究中的采样、DNA提取方法以及纯化技术的研究进展进行综合评述，旨在为植物基因组DNA的研究提供理论与技术参考。

从琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测的结果可以看出，菜花组织中酚类、多糖等化合物直接会影响实验中提取DNA的纯度和质量，因此从中提取DNA的关键是有效地除去这些杂质。

关键词：植物基因组DNA；提取；检测
Abstract: Genome refers to all the DNA cells, including all of the gene and gene room area. Plants in addition to the nucleus, besides the genome, which includes the cytoplasm genome mitochondrial genome and plasmids genome. Specific genomes, contains the species growth, development and reproduction and so on each physical activity almost all information. Research genomic DNA extracted DNA, demanding high purity and yield for PCR, RFLP analysis, gene library construction and gene detection etc follow-up study. About plants in recent years in the study of genomic DNA sampling, DNA extraction method and purification technology research progress on a comprehensive review aimed at the plant genomic DNA research provides theory and technique reference. From agarose gel electrophoresis and uv spectrophotometer testing results can be seen, cauliflower organization phenols, polysaccharide directly affect chemical compounds such as extracting DNA experiment, so the purity and quality is the key to extract DNA from effectively remove these impurities.
Key words: plant genomic DNA; extracted; detection
0 引言
基因组是指细胞中的所有DNA，包括所有的基因和基因间区域。

植物除了细胞核基因组外，还有细胞质基因组，后者包括线粒体基因组和质体基因组。

特定物种的基
因组，包含了该物种生长、发育以及繁殖等各项生理活动的几乎全部信息。

研究基因组DNA，要求提取的DNA要有较高的纯度和得率，以便用于PCR、RFLP分析、基因文库的构建以及基因探测等后续研究。

而在DNA的提取过程中,采样时间、提取方法以及纯化技术等因素都对提取DNA的纯度和得率有很大影响,进一步影响对DNA的分析等后续研究。

对近年来关于植物基因组DNA研究中的采样、DNA提取方法以及纯化技术的研究进展进行综合评述，旨在为植物基因组DNA的研究提供理论与技术参考。

掌握从高等真核生物细胞中制备基因组DNA的基本原理，熟悉从高等植物中提取基因组DNA的技术流程。

1 实验材料与方法
1.1 实验材料
实验材料的处理包括2个方面：一为实验材料的选择；二为实验材料的保存和预处理。

总体上讲，在材料的选取上，应尽量采用植物的幼嫩部位，但仍应根据实验条件如植物的生长周期、实验室离材料生长地的距离、植物本身的生化性质来选用何种部位为材料。

一般都取植物的嫩叶进行实验，而一些衰老的叶片则可以先在4℃的黑暗中饥饿1d，以消耗掉淀粉和其它多糖类物质。

除叶片外，植物的另外一些部位有时也可以成为较好的试验材料[1]。

1.1.1 实验材料的选择
实验材料以菜花幼嫩叶片为实验材料，采集新鲜叶片数片洗净后再用去离子水清洗2次，晾干，置于4℃冰箱冷藏室内备用。

1.1.2 实验材料的保存和预处理
为了得到高质量的基因组DNA，应采用正确的保存方法使得样品材料尽量不要受到机械损伤和不被氧化褐变，DNA不为内源核酸酶催化降解等。

常用的保存方法有低温保存和脱水干燥保存2种[2]。

1.2 实验方法
提取基因组DNA时，细胞裂解是必经的步骤，而能否得到高质量的DNA，这一步非常重要。

其中，裂解缓冲液的组成以及温浴的时间和温度都与结果有直接或间接的关系。

细胞裂解缓冲液中一般含有表面活性剂，常用的有CTAB和SDS。

缓冲液成分一般应根据分离对象、后续实验对DNA产品的质量及数量的要求不同进行选择和调整，缓冲液的pH、保护剂和表面活性剂的种类及含量等都要事先进行优化[3]。

1.2.1 CTAB缓冲液法
取超低温(-86℃)保存的健康无病斑菜花(约1g)，放置在冷冻的研钵中，在研磨时加入适量的抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮，用冷冻的研杵快速研磨成干粉状，装入1.5mL的Eppendorf中1/3体积，迅速加入680μL、65℃预热的CTAB缓冲液和100μLβ-巯基乙醇，上下颠倒数次，使材料与缓冲液充分混匀，然后置于65℃水浴中水浴1小时后，取出Eppendorf管稍冷却，加氯仿-异戊醇(24∶1)混合液至1.5mL，混合后于8000rpm离心10min，吸取上清，重复此步骤至看不到界面上有白色沉淀环。

加入2倍体积的冷乙醇或2/3体积的异丙醇，4℃静置30min,12000rpm离心20s，弃上清液，加入500μLDNA洗涤缓冲液，放置30min，倒去洗液，用70%乙醇洗涤2次，空气中自然干燥或用吹风机(冷风)吹干，溶于80μL0.1×TE中，置于-20℃保存备用[4]。

1.2.2 SDS缓冲液法
实验步骤：取幼嫩无病斑菜花(约1g)置于冰冻的研钵中，加入适量固体抗坏血酸和聚乙烯吡咯啉酮，研成粉末，装入1.5mL的Eppendorf中1/3体积，加入预热至65℃的提取介质680μL和β－巯基乙醇100μL，2%的抗坏血酸50μL和2%的聚乙烯吡咯啉酮50μL，65℃温浴1.5h，用氯仿-异戊醇抽提2—3次至界面上无白色沉淀环为止。

取上清液，加入2/3体积的2.5mol/L pH4.8的KAC溶液，2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液及β－巯基乙醇各10μL0℃放置30min后，低温(4℃10000rpm)离心10min，上清液中加入2倍体积的冷乙醇，4℃静置30min后，4℃12000rpm离心30s收集沉淀。

经洗涤缓冲液洗涤数次，再用70%乙醇洗涤2次，自然风干，并溶于40μL0.1×TE溶液中，置于-20℃保存备用[5]。

2 结果分析
2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
将所得的DNA样品于0.8﹪琼脂糖凝胶中进行电泳，用凝胶成像系统分析电泳结果，并判断DNA浓度及相对分子质量大小。

高盐溶液中除含有CTAB-核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。

用氯仿先对此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和多糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶液中；接着可用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀出来，然后用水或TE缓冲液等将核酸溶解。

由CTAB法、SDS法分离提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，其电泳带可见1条约15kb 的DNA主带，点样孔内无亮点，带型清晰无拖尾，说明所提取的DNA保持完好。

其中用CTAB法所提取的基因组DNA主带最亮、最清晰，提取的质量最好，DNA的质量浓度最大；
而用SDS法所提取的基因组DNA有降解现象[6]。

1：CTAB法；2：SDS法；
图：改进方法提取基因组DNA的比较
2.2 紫外分光光度计检测结果
将所得的DNA提取液于752型紫外分光光度计上测定波长260,280nm处的吸光度:根据A260/A280的值判断DNA纯度，以A260计算DNA质量浓度并得出DNA得率。

我们采用CTAB法、SDS法提取菜花的基因组DNA，在有效除去细胞内杂质，抑制次生代谢物与DNA的结合，所得的DNA溶液呈无色透明状。

将这两种方法所得的DNA 吸取10uL用去离子水稀释至3mL，在752型分光光度计上测定其A260，A280，判断其纯度得率。

用CTAB法、SDS法提取的基因组的A260/A280的值在1.8-2.0之间，纯度较高，符合分子生物学研究。

其中CTAB法所提取的DNA纯度最高，质量浓度也最大。

表：用不同方法提取的基因组DNA测定结果
2.3 实验结果分析
由琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测结果，我们可以清楚的看到在对菜花的基因组DNA提取的试验中，CTAB缓冲液法的效果明显比SDS缓冲液法好。

产生这种结果的主要原因可能是，CTAB缓冲液比较适用于草本植物和不含酚类或含酚类较少的植物DNA提取；SDS缓冲液在植物基因组DNA的提取中应用较少，主要应用于对模板DNA质量要求不太严的RAPD分析。

因此在提取菜花这种属于十字花科的植物来说，CTAB缓冲液对于提取其的DNA更加适合[7]。

3 实验讨论
从琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测的结果可以看出,菜花组织中酚类、多糖等化合物直接会影响实验中提取DNA的纯度和质量,因此从中提取DNA的关键是有效地除去这些杂质。

3.1 酚类物质
酚类物质是芳族环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物，广泛分布于植物体,是植物体内重要的次生物质之一。

酚类物质经氧化后易于DNA共价结合引起褐变以及在用氯仿抽提时的丢失。

为有效除去酚类物质，在研磨时加入抗坏血酸PVP，用PVP和抗坏血酸，是利用它的“-CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强，结合成复合物后，通过离心除去。

另外，在加入提取液时，加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚类物质被氧化，主要是“-SH基”可以打断多酚氧化物酶的二硫键而使之失活，防止酚类化合物被氧化。

提供-SH防止褐变的化合物很多，如二硫苏糖醇、B-巯基乙醇、半胱氨酸及抗坏血酸等。

选用哪种、什么浓度最合适要针对植物材料通过实验确定。

通过这些措施，可以防止酚类物质被氧化而使DNA褐化，从而得到白色DNA沉淀[8]。

3.2 多糖物质
多糖是影响植物DNA纯度的另一常见因素，这类化合物可于DNA同时沉淀，使DNA 提取物呈胶状，从而影响对DNA样品的浓缩，而且干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶的活性，影响用分光光度法对核酸进行定量分析等。

CTAB有一独到优点就是能有效沉淀多糖，再通过氯仿、异戊醇抽提，也可除去一部分多糖，但通过上述方法还不能完全。

除去多糖对脱皮榆DNA提取的影响。

实验中将DNA粗提物用TE溶液充分溶解，离心后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。

除了DNA纯度对后续操作影响较大外，DNA片段的长度对实验结果也有一定的影响[6]。

DNA对剪切力极为敏感，为了得到尽可能大的DNA片段，在提取过程中要注意以下的问题：应尽量简化操作步骤，减少转移DNA的次数，离心速度，离心时间等；提取过程中应温和操作，避免剧烈震荡，用较粗的枪头吸取上清液，吸取过程中避免产生气泡，不要通过反复吸打的方法助溶DNA。

为了得到质量较高的总DNA，在提取时，要特别注意取材，尽可能选取较嫩的叶组织。

由于个体的不同发育时期，组织细胞中的组成成分不同，以及随着个体发育，植物组
织细胞内的组成成分更加复杂多样，尤其是酚类化合物、多糖、萜类化合物以及一些次拿代谢物和一些未知化合物的含量增加，都会给总DNA提取带来困难。

总之，抗坏盂及B-SH等抗氧剂对木本植物基因组DNA的提取是必须的[9]。

参考文献：
[1]巩艳红,刘军.毛豹皮樟叶片DNA的提取[J].四川：四川林业科技.2003,(6):47-50.
[2]姜玲,蔡礼鸿.一种提取银杏中DNA的方法[M]．植物生理学通讯. 2003,(4):340-342.
[3]王珍,方宣钧．植物DNA分离[J]．分子植物育种.1(2):281-28.
[4]袁长春,施苏华.从富含酚类的茶类植物叶中提取纯净的总 DNA[J]．中山大学学报论丛.21(3):1.
[5]赵怀宝,冯建荣.葡萄DNA提取与纯化方法的比较研究[J].石河子大学学报(自然科学版).2000,4(2)117-211.
[6]李德葆.基因工程操作技术[M].上海:上海科学技术出版社.54-55.
[7]王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术[M].北京:科学出版社.1998,61l-613．
[8]潘瑞炽.植物生理学[M].北京：高等教育出版社.1999,34-65.
[9]邵莉楣.花卉化学促控技术[M].北京：金盾出版社.1993,12-23.
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论文（设计）题目：植物基因组DNA的提取及检测
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