基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(10): 1818−1826 /zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@
本研究由国家自然科学基金项目(31071406)和江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(2011-997)资助。

*
通讯作者(Corresponding author): 陈建民, E-mail: jmchen@, Tel: 0514-********
第一作者联系方式: E-mail: gjy19871013@, Tel: 0514-********
Received(收稿日期): 2012-02-23; Accepted(接受日期): 2012-06-06; Published online(网络出版日期): 2012-07-03. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20120703.0858.201209.0_015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01818
基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum )特异分子标记
葛江燕 陈士强 高营营 高 勇 朱 雪 黄泽峰 陈建民∗
扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009
摘 要: 分别以二倍体长穗偃麦草和普通小麦中国春的基因组DNA 作实验组和对照组, 运用抑制消减杂交(SSH)技术去除2个基因组DNA 之间的同源序列, 获得长穗偃麦草特异的DNA 片段构建的单向抑制消减文库, 并对随机克隆测序。

根据测序结果设计引物, 获得36个长穗偃麦草基因组特异分子标记, 成功率高达69.2%。

这些标记均能在具有长穗偃麦草E 染色体的不同小麦背景和不同世代中稳定表现, 可用于小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片段。

关键词: 普通小麦; 长穗偃麦草; 基因组特异分子标记; SSH
Development of Genome-Specific Molecular Markers for Lophopyrum elonga-tum Based on Suppression Subtractive Hybridization
GE Jiang-Yan, CHEN Shi-Qiang, GAO Ying-Ying, GAO Yong, ZHU Xue, HUANG Ze-Feng, and CHEN Jian-Min *
College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: The unidirectional subtracted library of the tester Lophopyrum elongatum (2n =2x =14, EE) and the driver wheat (Triti-cum aestivum cv. Chinese Spring, 2n =6x =42, AABBDD) was constructed by suppression subtractive hybridization (SSH) method to remove the homologous sequences and enrich the difference of sequences between L. elongatum and Chinese Spring. After cloning and sequencing the specific fragments of L. elongatum , we obtained 36 genome-specific molecular markers of L. elonga-tum with the efficiency of 69.2%. These markers could be stably inherited in different wheat backgrounds and different hybrid generations with L. elongatum chromosomes, indicating that they are applicable in the detection of chromosomes or chromosomal fragments of L. elongatum in wheat background.
Keywords: Triticum aestivum ; Lophopyrum elongatum ; Genome-specific molecular marker; Suppression subtractive hybridiza-tion
小麦(Triticum aestivum )是世界上种植面积最大、总产量仅次于玉米的粮食作物。

20世纪中期以来, 品种改良的成果使小麦单产和总产不断提高。

在育种过程中频繁地使用少数几个亲本, 使小麦品种的遗传组成趋向单一化, 势必减少小麦的遗传变异[1]。

从小麦野生近缘种中获取抗病、抗逆境的有利基因, 扩大小麦育种的基因库已经成为小麦遗传育种学家的共识, 如已成功地进行了小麦与大赖草(Leymus racemosus )、长穗偃麦草(Lophopyrum
elongatum )、中间偃麦草(L. intermedium )、黑麦(Secale cereale )、簇毛麦(Haynaldia villosa )等近缘种的杂交, 并获得了一些抗赤霉病的材料[2]。

长穗偃麦草是禾本科小麦族偃麦草属植物, 其E 基因组与小麦A 、B 、D 基因组的遗传分化程度相对较小。

该物种生长繁茂、多花多实, 具有抗多种小麦病害(赤霉病、锈病、白粉病、黄矮病等)和抗寒、耐盐碱、耐干旱以及高蛋白等许多优良性状, 是小麦遗传改良不可多得的优异外源基因供体[3]。

我
第10期葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记1819
国科学家李振声、陈溯阳等通过普通小麦与长穗偃麦草杂交, 先后育出了小偃4号、小偃5号、小偃6号等系列优良品种, 充分证明长穗偃麦草在小麦遗传改良中的重要作用[4]。

通常, 远缘杂交后通过常规选择方法获得具有偃麦草属有利基因的小麦个体难度大、周期长。

随着分子生物学技术的发展, 借助DNA分子标记可直接检测外源遗传物质的存在及基因组水平的差异。

目前, 分子标记已经在种质资源的鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱的构建、分子标记辅助育种及基因克隆等领域得到了应用。

开发长穗偃麦草特异的分子标记, 对于从小麦背景中检测长穗偃麦草染色质快捷有效, 如明确这些分子标记与长穗偃麦草中相关抗性基因的连锁关系, 则作为标记可在小麦育种中利用长穗偃麦草优良基因时进行辅助选择而提高选择效率。

长穗偃麦草的1E 染色体[5-6]和7E染色体上均发现有较强的抗赤霉病基因[7-10]。

通过1E和7E染色体特异分子标记进行辅助选择, 将有利于提高利用长穗偃麦草的抗赤霉病基因进行小麦抗赤霉病育种的效率。

开发有效的长穗偃麦草特异分子标记将是标记辅助选择的重要前提, 目前, 已利用RGAP[11]、RFLP[12]、RAPD、SSR[13-15]和AFLP[16]标记技术开发了一些长穗偃麦草特异分子标记, 但均存在效率不高、标记数量有限、稳定性不好等缺点。

因此, 开发更多且稳定的长穗偃麦草特异分子标记对于利用长穗偃麦草进行小麦遗传改良具有重要作用。

抑制消减杂交(suppression subtractive hybridi-zation, SSH)是以mRNA差别显示技术为基础, 将消减杂交与抑制PCR相结合抑制非目的基因片段扩增而选择性扩增目的基因片段的技术[17-19]。

SSH技术特别适合于分离植物发育阶段转型前后, 个体内不同器官之间, 以及受环境因子影响较大的差异表达基因[20]。

如小麦在逆境胁迫条件下对细胞保护作用的有关基因[21], 与能量和初级代谢相关的基因[22], 与信号转导、转录调控等相关基因[23]。

依据该技术的原理, 本研究以二倍体长穗偃麦草基因组DNA为实验组, 普通小麦中国春基因组DNA为对照组, 通过2轮消减杂交可去除实验组和对照组之间的同源序列而获得丰度较低的差异片段, 这些差异片段可视为长穗偃麦草DNA特异片段, 在其两侧连接不同序列的接头, 再结合2轮抑制性PCR的富集, 能高效地扩增出长穗偃麦草特异DNA片段。

经回收、测序, 最后转化成长穗偃麦草基因组特异分子标记。

这些标记可以用来检测小麦背景中的长穗偃麦草染色质, 为利用长穗偃麦草进行小麦抗病以及抗逆境育种的分子标记辅助选择提供坚实的基础。

此外, 该研究可为小麦育种中快速便捷检测外源染色质的分子标记开发提供借鉴。

1材料与方法
1.1植物材料及其DNA提取
普通小麦中国春、二倍体长穗偃麦草(EE)、中国春-长穗偃麦草二体附加系(DA1E、DA2E、DA3E、DA4E、DA5E、DA6E和DA7E)和长穗偃麦草代换系[DS3E(3D)、DS3E(3A)、DS7E(7A)], 以上材料由加拿大农业部Fedax博士惠赠。

扬麦158、扬麦16、宁麦13、0425、扬麦14和安农8455由江苏省里下河地区农业科学研究所程顺和院士提供。

以长穗偃麦草不同代换系与普通小麦品种进行杂交, 其中代换系DS3E(3D)与安农8455杂交, 代换系DS3E(3A)和DS7E(7A)分别与扬麦16杂交。

供试材料生长至二叶一心期, 以改良后的SDS 法[24]提取基因组DNA。

1.2引物设计
根据NCBI (/nuccore)公布的18S rRNA基因的核苷酸序列(GenBank登录号为HQ870412.1), 在2个Rsa I位点间序列设计引物18S-254, 其序列分别为F: 5′-GCTCTGGATACA TTAGCATGGGATA-3′和R: 5′-TCGGCATCGTTTAT GGTTGAG-3′, 扩增片段长度为254 bp, 该扩增片段可在构建文库时检测连接效率和消减效率。

依据试剂盒(PCR-Select cDNA Subtraction Kit, Clontech)提供的接头1 (adaptor 1) 和接头2R (adaptor 2R)序列设计3个引物, 即PCR primer 1 (5′-CTAATACGA CTCACTATAGGGC-3′)、Nest primer 1 (5′-TCGAGC GGCCGCCCGGGCAGGT-3′)和Nest primer 2 (5′-A GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′)。

1.3 SSH文库构建
1.3.1 DNA酶切和连接通过Rsa I酶(Clontech)对长穗偃麦草、中国春小麦的基因组DNA进行酶切, 酶切反应总体积50 μL, 37℃温育24 h, 中间补加一次Rsa I 1.5 μL。

将长穗偃麦草的酶切产物分别与接头1、接头2R连接, 检查连接产物的连接效率, 按PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书对连接产物进行2轮消减杂交和2轮PCR扩增。

1.3.2 消减杂交第1轮消减杂交是将具有接头
1820作物学报第38卷
1和接头2R连接的长穗偃麦草Rsa I酶切基因组DNA分别与中国春小麦Rsa I酶切基因组DNA (100 ng μL−1)混合, 完成杂交后立即进入第2轮。

在无菌PCR管中混合变性后的中国春小麦Rsa I酶切基因组DNA和第1轮杂交产物, 68℃温育24 h后加入200 μL稀释液, 68℃ 7 min终止非特异性杂交, −20℃保存。

1.3.3 抑制性PCR扩增取稀释后的第2轮消减杂交产物、未消减杂交对照DNA分别加至无菌PCR 管中进行第1轮抑制性PCR。

首先在72℃作用5 min 以补平接头, 紧接着, 94℃ 2 min; 94℃ 45 s, 66℃ 45 s, 72℃ 1.5 min, 28个循环; 72℃ 5 min。

取第1轮PCR 产物稀释10倍后作为第2轮PCR的模板。

反应体系中除以Nest primer 1和Nest primer 2 (10 μmol L−1)替换PCR primer 1外, 其他成分相同。

第2轮PCR 程序为94℃ 2 min; 94℃ 45 s, 68℃ 45 s, 72℃ 1.5 min, 15个循环; 72℃ 5min。

用2%琼脂糖电泳检测扩增产物。

其余样品保存于−20℃。

扩增反应在Eppendorf梯度PCR仪(Mastercycler pro)中完成。

1.3.4 消减杂交效率取稀释10倍后的消减杂交与未消减杂交对照的2轮PCR产物, 加入引物18S-254 F和18S-254 R, 扩增程序为94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 50℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 18个循环; 取出5 μL产物后剩余样品继续进行5个循环, 再取出5 μL产物, 照此每5个循环重复一次, 直至38个循环。

以2%琼脂糖凝胶电泳检查所有扩增进程的PCR 结果。

1.3.5 消减片段的连接反应将经过消减后的第2轮PCR产物与pMD18/19-T载体(TaKaRa, Code D102A)连接。

以连接产物转化感受态大肠杆菌(E. coli), 蓝白斑筛选构建抑制消减杂交文库。

1.4长穗偃麦草标记开发和稳定性检验
挑取单个白色菌落, 利用引物Nest primer 1和Nest primer 2进行菌落PCR。

PCR程序为94℃ 5 min; 94℃ 45 s, 68℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 35个循环; 72℃10 min。

用2%琼脂糖电泳检测PCR产物。

根据菌落PCR的结果, 选择大小合适的阳性克隆测序, 将测序结果与已公布的小麦基因组序列比对, 选择与小麦近缘物种同源性高或与小麦同源性低的序列设计引物, 对长穗偃麦草的7个附加系和6个小麦品种进行PCR扩增, 根据扩增结果获得稳定的基因组特异分子标记。

选择特异分子标记MEG-1303检验长穗偃麦草代换系与普通小麦的杂种F1~F3代, 以验证标记的稳定性。

2结果与分析
2.1 实验组酶切片段与接头连接效率
长穗偃麦草和中国春小麦基因组DNA经Rsa I 酶切后的电泳结果显示, 未消化的基因组DNA位于凝胶加样孔的顶端, 表明提取的基因组DNA没有发生降解, 质量较好。

而消化后的基因组DNA则表现为小于2 500 bp弥散的片段, 酶切后DNA片段集中在200~2 000 bp, 和预期结果一致。

将酶切后的实验组DNA片段与接头1和接头2R连接得到实验组-1和实验组-2。

以18S rRNA为参照基因, 利用其特异性引物18S-254 F和18S-254 R, 在实验组-1和实验组-2中扩增出长度为254 bp的片段, 而对具接头的片段, 而利用PCR primer 1和18S-254 F可扩增出850 bp 左右的片段, 从2种长度片段的亮度比较可反映连接效率。

以实验组-1和实验组-2为模板, 用引物PCR primer 1和18S-254 F获得850 bp左右的片段, 表明连接成功。

该产物的亮度相当于18S-254 F和18S-254 R扩增所得产物的亮度的1/4, 符合试剂盒中连接效率的标准, 表明酶切产物与接头的连接效率满足要求(图1-A)。

2.2两轮抑制性PCR及消减效率
以长穗偃麦草和中国春小麦基因组DNA经消减杂交和未消减杂交的产物和未经消减杂交的产物为模板分别进行2轮PCR, PCR产物均呈现连续的弥散型条带(图1-B), 消减组产物主要分布在150~2 000 bp的范围内, 与酶切产物的片段大小相近, 而在弥散的条带中还有一些较集中的扩增条带, 应为实验组中特有的差异片段。

经第2轮PCR扩增, 其产物浓度高于第1轮PCR。

说明经过2次PCR使差异片段特异性扩增, 从而得到富集。

以消减组的PCR产物和未消减组的PCR产物为模板, 利用引物18S-254 F和18S-254 R进行消减效率的分析。

未消减组在18个循环即出现254 bp 的特异性条带, 而消减组在23个循环才表现254 bp 的特异性条带(图2), 说明本研究的消减效率较高。

2.3消减文库的构建
通过热激法转化感受态大肠杆菌, 共挑取454个白色菌落构建抑制消减文库。

图3-A为部分菌落PCR结果, 插入片段大小不等, 其范围为150~2 000 bp, 消减文库构建成功, 可用于长穗偃麦草特异片段的测序分析。

第10期
葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum )特异分子标记 1821
图1 酶切片段与接头的连接效率及两轮PCR 结果
Fig. 1 Ligation efficiency of digestion fragments with adapters and products after two rounds of PCR
照片A 中, M: DL2000; 1: 扩增引物为PCR primer 1/18S-254 F; 2: 扩增引物为18S-254 F/18S-254 R 。

照片B 中, M: DL2000; 第1轮
PCR 的引物为primer 1, 第2轮PCR 的引物为Nest primer 1和Nest primer 2。

1: 消减后; 2: 未消减。

In panel A, M: DL2000; 1: Amplification with primer pair PCR primer 1/18S-254 F; 2: Amplification with primer pair 18S-254 F/18S-254 R. Tester-1: digested DNA fragments ligated to adaptor 1; Tester-2: digested DNA fragments ligated to adaptor-2R. In panel B, M: DL2000; primary PCR was conducted with primer 1, and second PCR was conducted with Nest primers 1 and 2. 1: PCR products after subtraction;
2: PCR products without subtraction.
图2 消减杂交的效率
Fig. 2 Efficiency of subtractive hybridization
M: DL2000; 1~5: 消减后2轮PCR 产物, 扩增循环数依次为18、23、28、33和38; 6~10: 未消减2轮PCR 产物, 扩增循环数依次为
18、23、28、33和38。

M: DL2000; 1–5: Two rounds of PCR products after subtraction with amplification cycles of 18, 23, 28, 33, and 38, respectively; 6–10: Two
rounds of PCR product without subtraction with amplification cycles of 18, 23, 28, 33, and 38, respectively.
图3 消减文库克隆(A)及基因组特异分子标记(B)
Fig. 3 PCR-amplified differential clone inserts from the subtractive library (A) and genome-specific molecular marker (B) 照片A 中, M: DL2000; 1~14泳道为不同克隆。

照片B 中, M: DL2000; 1~7泳道依次为中国春–长穗偃麦草附加系DA1E 、DA2E 、DA3E 、DA4E 、DA5E 、DA6E 和DA7E; 8泳道为二倍体长穗偃麦草; 9~14泳道依次为普通小麦中国春、扬麦158、扬麦16、宁麦13、0425
和扬麦14。

In panel A, M: DL2000; lanes 1–14 were loaded with different clones. In panel B, M: DL2000; lanes 1–7 were loaded with PCR products from template DNAs of Chinese Spring-Lophopyrum elongatum addition lines DA1E, DA2E, DA3E, DA4E, DA5E, DA6E, and DA7E, re-spectively; lane 8 was loaded with PCR product from template DNA of L. elongatum (EE); and lanes 9–14 were loaded with PCR products from template DNAs of wheat varieties Chinese Spring, Yangmai 158, Yangmai 16, Ningmai 13, 0425, and Yangmai 14, respectively.
1822
作 物 学 报 第38卷
2.4 基因组特异分子标记
随机挑取55个插入片段在400 bp 以上的克隆进行测序, 并对测序结果进行网上比对(http://blast. /), 去除90%以上区段与小麦同源性大于90%的8条序列, 以90%以下区段与小麦具
有不同程度同源性的47条序列设计了52对引物。

对7个附加系、二倍体长穗偃麦草(EE)和6个普通小麦品种进行PCR 扩增, 图3-B 为引物MEG-2301的扩增结果, 共获得36个长穗偃麦草基因组特异分子标记(表1)。

以测序的克隆计算, 开发标记的成功率
表1 长穗偃麦草基因组特异分子标记的引物序列
Table 1 Primer sequences of genome-special molecular markers for L. elongatum
序列 Sequence (5′–3′)
序号 Series No. 引物1)
Name of primer 1)
正向 Forward
反向 Reverse
扩增的染色体2)
Amplified chromosome 2) 1 MEG-1303 TGGATGGTGGCTGCTGAT CCGTTATGCTGCCCGATT 1E–7E (7) 2 MEG-1258 ACCAGCGGTAGCCCAGTCT ATCTGTGCGATTTCCCTA 1E–7E (7) 3 MEG-1253
CCAGCGGTAACCCAGTCT
AGTGCGATTTCCCTGACG
5E, 7E (2) 4 MEG-1211 GCTCATCAACAGCCTACC TGTGACTTTCCCACCATT 1E–7E (7) 5 MEG-1242 GAAAGGCTCCGAGAACAC GTCAAAGGCTTAGCAATC 1E–7E (7) 6 MEG-1177 TTGGGCTCAAGAACATTA GGCAGGTACGACACCTAT 1E–7E (7) 7 MEG-2301 TGTGCTGAGCCCGAAGAT TGGAACGGATGAAGACCC 1E–7E (7) 8 MEG-2249 GCCGACTCAGGAGGTGTT TTGCATCCGTTGGTATTG 1E–7E (7) 9 MEG-2304 TGTCCCACCATTGAGCAG CCGGGCAGGTTAGACTATA 2E, 4E, 5E, 6E, 7E (5) 10 MEG-2237 CAGTGGCTTGTCAGAGTT CGTAGCAGGATGGTTAGA 2E, 3E, 4E, 5E, 6E, 7E (6) 11 MEG-2422
GCTTGCGTCATCTCCTTC
TGATATGCCACTTCTCCTC
4E, 5E, 7E (3) 12 MEG-2407 TTAGTTAGGCAGTAGAGCA
CGACAAAGTAAGGTGGTG 1E–7E (7) 13 MEG-2371 TGGGTAATGCCCGTCCTC TCTGAATGTTTCCGCTTGT 1E–7E (7) 14 MEG-3258 ATAGGGTTGCCAGTGAGGAG
GATTCATCATTTCCCATAGAG 1E–7E (7)
15 MEG-3273 TTTACAAGGTGAAGGTCT CATTGCGGACTATGATTT 1E–7E (7) 16 MEG-3236 AGTGGCTTGTCAGAGTTG CGTAGCAGGATGGTTAGA 1E–7E (7) 17 MEG-3239 TGCGATTTCCCTGTCATT
TCCCAGCCAGATCAAGAG
1E–7E (7) 18 MEG-3254 ATCTGTGCGATTTCCCTG GCGGTAGCCAAGTCTGGT 1E–7E (7)
19 MEG-3253 CCAGCGGTAACCCAGTCT AGTGCGATTTCCCTGACG 1E, 2E, 4E, 5E, 6E, 7E (6) 20 MEG-3293 TGTTCACTCAGCCATCTC ATCAACTTCAGCATCTTTA 1E–7E (7) 21 MEG-3267 AGGGGCAACAAGGATAAG TACACTACCGACGAGCAG 1E–7E (7) 22 MEG-3367 ATGAGCCCAGTTGAGTTGTTT TACTATGGTTGACCACCTAAAGAG 1E–7E (7)
23 MEG-3211 GCTCATCAACAGCCTACC TGTGACTTTCCCACCATT 1E–7E (7) 24 MEG-4265 TAACGCCGACACTTAGGA GGAAACCCAGGGACATCA 1E–7E (7) 25 MEG-4253 CCTTGTGAGCCCAGTTAT GCAGGTTCTTCCACCATTA 1E–7E (7) 26 MEG-4268 GCTTGCGTCATCTCCTTC TTCGGTCATAGTTGCTCTTC 1E–7E (7) 27 MEG-4280 CCGTCTGTTACTCCATCG CTCTGAAGCGGCGTCTGC 1E–7E (7) 28 MEG-4353 CCTTGTGAGCCCAGTTAT GCAGGTTCTTCCACCATTA 1E–7E (7)
29 MEG-4483 ATCCCAATCTCAAATCAAG TCAAATACTCAGCACGAAT 2E,
3E, 5E, 7E (4) 30 MEG-5350 CCCCAGGCAGAGGAACTA CCCGGGCAGGTACATCTC 1E, 3E, 4E, 5E, 6E, 7E (6) 31 MEG-5385 CAATCTCGGAGCCATCAT GGCCAGGTTCACATAAGG 5E (1)
32 MEG-5260 CATCTTCAGCGGTCTTGC CGAGCGTGTTGGGTAAGT 1E, 2E, 3E, 4E, 5E, 7E (6) 33 MEG-5377 AAGTCAAGGCTGTCCCATA
ACTTTTCCCATGCTCACA 1E–7E (7) 34 MEG-5254 ATTGAGCCTGCCGTAGAG GTCATTGAGCGTATCCTGTT 1E–7E (7) 35 MEG-5456 TCGCTGTCGTGCTTATCT TGTATTTGGTGTTCCCTCC 1E–7E (7) 36 MEG-5333 TTTGTGACGAAGAGGAGCAT
GCCCGTAGACAGGAGAAGT
1E–7E (7)
1)
引物名称中的字母和数字依次表示分子标记(M)、二倍体长穗偃麦草(E)、基因组(G)、测序批次(1~5)和扩增片段大小。

2) 括
号中数字表示扩增的染色体数目。

1)
Primers are named with orderly letters and figures, which represent for molecular marker (M), L. elongatum (E), genome (G), se-quencing batch (1–5), and size of the amplified segment. 2) The number of E chromosomes amplified is given in the parenthesis.
第10期葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记1823
为65.5%; 以设计的引物计算, 则成功率为69.2%。

在36对长穗偃麦草基因组特异分子标记的引物中, 27对能特异扩增出长穗偃麦草7条E染色体, 4对能特异扩增6条E染色体, 各有1对能特异扩增出1~5条E染色体(表1), 表明所开发的基因组特异分子标记仅在长穗偃麦草中稳定出现, 可以在不同小麦背景和不同世代中跟踪E组染色体。

2.5基因组特异分子标记稳定性
引物MEG-1303在代换系DS3E(3D)与安农8455、代换系DS3E(3A)与扬麦16、代换系DS7E(7A)与扬麦16杂交的不同后代中的扩增条带大小与预期相同(图4)。

长穗偃麦草代换系、杂种F1代均能扩增出目标片段, 但在小麦中没有相应的扩增产物。

在杂种F2代中扩增产物有与无的分离比约为3∶1, 表明该引物能够有效地检测出不同小麦背景杂交后代中的3E染色体, 相同分子标记在同一杂交组合的不同世代中可以稳定遗传(图4-A)。

7E染色体也同时能被有效检出(图4-B), 图中F3单株是来自F2的1个单株, 说明该标记可以甄别2条7E染色体的纯合个体。

图4特异引物MEG-1303在长穗偃麦草代换系与普通小麦品种杂交后代中的扩增结果Fig. 4 Amplification profile of specific primer MEG-1303 in the progenies of hybrid between L. elongatum substitution lines and
common wheat varieties
照片A中, M: DL2000; 1: DS3E (3D); 2: 安农8455; 3和4: DS3E (3D) × 安农8455的F1代; 5: DS3E(3A); 6: 扬麦16; 7~21: 扬麦16 × DS3E(3A)的F2代。

照片B中, M: DL2000; 1: DS7E (7A); 2: 扬麦16; 3和4: 扬麦16 × DS7E(7A)的F1代; 5~21: 扬麦16 × DS7E (7A)
的F3代。

In panel A, M: DL2000; 1: DS3E (3D); 2: Annong 8455; 3 and 4: F1 generation of DS3E (3D) × Annong 8455; 5: DS3E (3A); 6: Yangmai 16; 7–21: F2 generation of Yangmai 16 × DS3E (3A). In panel B, M: DL2000; 1: DS7E (7A); 2: Yangmai 16; 3 and 4: F1 generation of Yangmai
16 × DS7E (7A); 5–21: F3 generation of Yangmai 16 × DS7E (7A).
3讨论
3.1利用SSH技术开发特异标记的可行性
在长穗偃麦草中寻找新的操作简便、花费低、重复性好的分子标记已经成为有效利用长穗偃麦草优良种质的一项重要内容。

相对于染色体特异分子标记而言, 基因组特异分子标记较易获得。

采用RAPD、RFLP、SSR引物或随机引物的方法开发了部分长穗偃麦草E染色体组的特异分子标记[12-15], 但其效率太低。

利用PCR增效减法杂交的方法从长穗偃草基因组中分离出2个基因组特异重复序列pThe124和pThe125, 它们可开发为长穗偃草基因组特异分子标记, 但同样存在效率不高的问题[25]。

陈国跃等[11]根据已知植物抗病基因编码氨基酸保守区域设计了简并引物, 利用42个引物组合构建了一套完整的长穗偃麦草1E~7E染色体的30个特异RGAP 标记。

张丽等[16]用5对AFLP引物获得二倍体长穗偃麦草E染色体组7个不同染色体上的28个特异AFLP标记, 将其中的4个标记成功转换为结果稳定、操作更简单的序列特异性的STS分子标记, 并证实这些标记为长穗偃麦草所特有, 可用于外源长穗偃麦草遗传物质的检测。

上述研究中开发分子标记的方法均存在操作繁琐、效率不高的缺陷。

由于偃麦草的基因组序列未知, 其与普通小麦基因组又存在较高的同源性, 这给特异标记的开发带来一定的难度。

本研究的主要目的是获得长穗偃麦草基因组特异的DNA片段, 在此基础上开发特异分子标记。

我们利用SSH技术获得去除了小麦和长穗偃麦草的同源序列后的差异序列即为长穗偃麦草的特异片段, 经测序可用于开发长穗偃麦草基因组特异分子标记。

本研究构建了包含454个克隆的抑制消减杂交文库, 随机选取其中55个克隆进行测序, 并根据47条序列的测序结果设计了52对引物, 最终成功获得基因组特异分子标记36个, 按设计引物计算, 成功率高达69.2%。

由此可见, 通过SSH开发基因组特异分子标记的方法不仅
1824作物学报第38卷
可行, 而且具有相对较高的效率。

分析成功开发基因组特异分子标记的36对引物所对应的片段序列发现, 全序列与小麦其他近缘种同源的占50%, 换言之, 与现有网上公布小麦序列不同源的占50%。

全序列与小麦同源性片段小于90%的占41.7%, 而全序列与小麦同源性片段大于90%的仅占8.3%。

16对引物未成功获得基因组特异分子标记, 其中全序列与小麦近缘种同源的占56.2%, 全序列与小麦同源性片段小于90%的占18.8%, 而全序列与小麦同源性片段大于90%的占25.0%。

成功和未成功获得基因组特异分子标记所对应的序列分析表明, 测序结果经在线比对首先选择与小麦同源性低而与小麦近缘种有较高同源性的片段, 如与山羊草属、大麦属、百萨偃麦草、短柄草等同源, 与近缘种序列同源性高就很容易获得基因组特异分子标记。

其次选择全序列与小麦同源性的片段小于90%的序列进行引物设计。

选取这些片段中与小麦同源性低的位置, 遵循引物设计的一般原则, 比较容易获得基因组特异分子标记。

本研究对SSH技术进行改良后以基因组DNA 为材料, 通过SSH技术去除小麦和长穗偃麦草基因组DNA间的同源序列, 获得长穗偃麦草基因组特异DNA片段。

虽然基因组DNA远大于cDNA, 且复杂性也有所增加, 但理论上两者都为DNA双链片段, 并且都能够很好地完成酶切、连接、2轮消减杂交与2轮抑制PCR。

由于基因组DNA具有内含子等系列, 而cDNA中没有内含子等系列结构, 使得在以基因组为起始材料时, 基因组DNA比cDNA增加了许多非编码区序列以及内含子序列。

因此, 在进行消减杂交时, 应尽量减小基因组DNA的复杂性。

本研究对基因组DNA进行较长时间酶切(24 h), 并且中间补加一次酶, 使酶切后的最大起始片段降低为2 000 bp以下, 从而在一定程度上降低了基因组DNA的复杂性。

由于片段的缩短使得小麦与长穗偃麦草DNA序列同源性高的片段出现的几率增加, 有利于通过消减杂交去除小麦和长穗偃麦草基因组DNA间的同源序列。

将酶切后的对照组、实验组产物浓度分别定为100 ng μL−1和80 ng μL−1。

尽管长穗偃麦草与小麦具有较高的同源性, 但它们的基因组DNA 差异仍然存在, 通过SSH技术可将差异扩大化, 从而使所构建的SSH文库的质量进一步提高。

3.2 基因组特异分子标记的应用
在作物育种研究中, 远缘杂交常被用于丰富作物的遗传背景、拓宽遗传变异。

小麦是异源六倍体, 是最容易进行远缘杂交的作物, 已经获得多种远缘杂种[2]。

在远缘杂交中, 整个基因组增加或个别染色体置换无法达到目的, 而获得含有外源优良基因的易位系则是最理想结果, 这样既获得了外源有利基因, 又保持了小麦基因组的完整性。

基因组特异分子标记可以对远缘杂交后代的外源染色质进行全面检测, 所以基因组特异分子标记在远缘杂种的鉴定中具有重要作用。

基因组特异分子标记也可以用于特定染色体或染色体片段的检测。

向小麦导入外源染色质通常是利用已知有利基因所在特定染色体代换系和小麦品种杂交, 在杂交后代中同样可以利用基因组特异分子标记进行检测, 因基因组特异分子标记在染色体间的相似性, 每次检测的结果都能表示特定染色体的存在与否。

在本研究中, 利用引物MEG-1303分别对DS3E(3D)×安农8455的杂交F1代、扬麦16×DS3E(3A)的F2代、扬麦16×DS7E(7A)的F1代、F3代检测, 结果开发的基因组特异分子标记在具有E组染色体的不同小麦背景和不同世代间均稳定表现, 且与预期结果一致, 说明可利用这些标记对长穗偃麦草染色体或染色体片段在世代间跟踪检测。

同时, 也证明利用基因组特异分子标记可以检测单个染色体, 在每次检测中就相当于染色体特异标记。

当基因组特异分子标记的数量增加时, 利用小麦-长穗偃麦草附加系进行PCR扩增, 势必存在染色体特异的标记, 这对检测特定染色体更具有目标性。

因此, 利用基因组特异分子标记不但可以检测小麦背景中的长穗偃麦草染色质, 为小麦育种中长穗偃麦草染色质的快速便捷检测提供新途径, 而且可以为长穗偃麦草相关染色体上抗病、抗逆基因的定位和克隆奠定基础, 并作为标记为小麦遗传改良中利用长穗偃麦草的抗病和抗逆基因进行有效的辅助选择。

另外, 除偃麦草属向小麦转移有利基因外, 其他小麦近缘种也具备有利基因可以向小麦转移。

本研究采用的技术路线也可以用于小麦其他野生近缘种的特异标记开发, 达到跟踪或检测小麦背景中外源染色质的目的, 为小麦的遗传改良研究提供方便快捷的检测手段。

4结论
通过抑制消减杂交可去除长穗偃麦草和普通小麦中国春2个基因组DNA之间的同源序列。

以差异片段构建消减文库和对随机克隆测序, 获得36个长
第10期葛江燕等: 基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记1825
穗偃麦草基因组特异分子标记, 成功率高达69.2%。

所获标记的特异性稳定, 均能在含有长穗偃麦草E 染色体的不同小麦背景和不同杂交世代中表现, 可用于在小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片段。

References
[1] Jia J-Z(贾继增), Zhang Z-B(张正斌), Devos K, Gale M D. The
genetic diversity analysis of wheat 21 chromosomes RFLP graphic site. Sci China: Ser C (中国科学·C辑), 2001, 31(1): 13–21 (in Chinese)
[2] Oliver R E, Cai X, Xu S S, Chen X, Stack R W. Wheat-alien spe-
cies derivatives: a novel source of resistance to Fusarium head blight in wheat. Crop Sci, 2005, 45: 1353–1360
[3] Lü W-D(吕伟东), Xu P-B(徐鹏彬), Pu X(蒲训). Summary of the
situation for applying genetic resources from Elytrigia in Triti-
cum aestivum breeding. Acta Pratacult Sin (草业学报), 2007, 16(6): 136–140 (in Chinese with English abstract)
[4] Chen S-Y(陈漱阳), Zhong G-C(钟冠昌). The new development
of the study on breeding of Triticum L. distant hybridization. In: Liu H-L(刘后利) ed. Crop Breeding Research and Progress (作
物育种研究与进展). Beijing: China Agriculture Press, 1993. pp 36–59 (in Chinese)
[5] Liu D-C(刘登才), Zheng Y-L(郑有良), Wang Z-R(王志容), Hou
Y-C(侯永翠), Lan X-J(兰秀锦), Wei Y-M(魏育明). Distribution of chromosomes in diploid Lophopyrum elongatum (Host) that influences resistance to head scab of common wheat. J Sichuan Agric Univ (四川农业大学学报), 2001, 19(3): 200–205 (in Chi-
nese with English abstract)
[6] Jauhar P P, Peterson T S, Xu S S. Cytogenetic and molecular
characterization of a durum alien disomic addition line with en-
hanced tolerance to Fusarium head blight. Genome, 2009, 52: 467–483
[7] Somers D J, Fedak G, Savard M. Molecular mapping of novel
genes controlling Fusarium head blight resistance and deoxyni-
valenol accumulation in spring wheat.Genome, 2003, 46: 555–564
[8] Shen X R, Kong L R, Ohm H. Fusarium head blight resistance in
hexaploid wheat (Triticum aestivum)-Lophopyrum genetic lines and tagging of the alien chromatin by PCR markers. Theor Appl Genet, 2004, 108: 808–813
[9] Shen X R, Ohm H. Fusarium head blight resistance derived from
Lophopyrum elongatum chromosome 7E and its augmentation with Fhb1 in wheat. Plant Breed, 2006, 125: 424–429
[10] Zhang X L, Shen X R, Hao Y F, Cai J J, Ohm H W, Kong L R. A
genetic map of Lophopyrum ponticum chromosome 7E, harbor-
ing resistance genes to Fusarium head blight and leaf rust. Theor
Appl Genet, 2011, 122: 263–270
[11] Chen G-Y(陈国跃), Dong P(董攀), Wei Y-M(魏育明), He K(何
坤), Li W(李伟), Zheng Y-L(郑有良).Development of E e-
chromosome-specific RGAP markers for Lophopyrum elongatum
(Host) in wheat background by using resistance gene analog polymorphism. Acta Agron Sin (作物学报), 2007, 33(11): 1782–1787 (in Chinese with English abstract)
[12] Liu S-B(刘树兵), Jia J-Z(贾继增), Wang H-G(王洪刚), Kong
L-R(孔令让), Zhou R-H(周荣华). Identification of homoeology between the Elytrigia elongatum (2n = 14, EE) and wheat chromosomes using biochemical and molecular markers. Acta
Agron Sin (作物学报), 1999, 26(1): 37–42 (in Chinese with English abstract)
[13] Liu S-B(刘树兵), Jia J-Z(贾继增), Wang H-G(王洪刚), Kong
L-R(孔令让), Zhou R-H(周荣华). Special chromosome markers for E genome and DNA polymorphism between Agropyron
elongatum (2n = 14) and common wheat detected by RAPD markers. Acta Agron Sin (作物学报), 1998, 24(6): 687–690 (in Chinese with English abstract)
[14] You M-S(尤明山), Li B-Y(李保云), Tang Z-H(唐朝晖), Liu
S-B(刘守斌), Song J-M(宋健民), Mao S-F(毛善锋), Liu G-T(刘
广田). Establishment of E-genome-specific RAPD and SCAR markers for Thinopyrum spp. J China Agric Univ (中国农业大学
学报), 2002, 7(5): 1–6 (in Chinese with English abstract)
[15] You M-S(尤明山), Li B-Y(李保云), Tian Z-H(田志会), Tang
Z-H(唐朝晖), Liu S-B(刘守斌), Liu G-T(刘广田). Develop-
ment of specific SSR marker for E e-genome of Thinopymm sp.
by using wheat microsatellites. J Agric Biotechnol (农业生物
技术学报), 2003, 11(6): 577–581 (in Chinese with English abstract)
[16] Zhang L(张丽), Yan Z-H(颜泽洪), Zheng Y-L(郑有良), Liu
D-C(刘登才), Dai S-F(代寿芬), Zhang L-Q(张连全), Wei Y-M(魏育明). Development of E e-chromosome specific AFLP and STS molecular marker for Lophopyrum elongatum in Chi-
nese Spring wheat background.J Agric Biotechnol (农业生物技
术学报), 2008, 16(3): 465–473 (in Chinese with English ab-
stract)
[17] Diachenko L, Lau Y F, Campbell A P, Chenchik A, Maqadam F,
Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov E D,
Siebert P D. Suppression subtractive hybridization: a method for
generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 6025–6030
[18] Diatchenko L, Lukyanov S, Lau Y F, Siebert P D. Suppression。