许氏平鲉微卫星多重PCR体系构建及亲本对子代贡献率

第' 期
& 韩慧宗等许氏平微卫星多重 U(T体系构建及亲本对子代贡献率
'B

+3\,* ## 长 牡 蛎 "#$%%&%'#($ 121$% #! 紫 菜 B&#*.4#$ .$2'$!(!%2% #A 等 基 于 单 个 微 卫 星 位
技术让其自由交尾 待到 !"#% 年 ' 月底雌雄亲 退火温度引物浓度比例反应体系等条件去优化确
鱼未出现死亡现象有 ' 尾雌性亲鱼腹部隆起明显 定最佳的反应条件
分别放于 ' 个养殖池内待产于 F 月 # 日至 F 月 A 日 三天内分别产出自由游动的仔鱼 样品采集 #" 个雄 性亲鱼背鳍编号为 Q3#Q3!Q3A Q3#"于 % 月 份样品采集 ' 尾雌性亲鱼背鳍编号为 .,#.,!.,A 和 .,'每尾雌鱼所产后代为 # 个雌亲家系 即半同 胞家系 每个雌亲家系取子代 B' 尾均放置于 %FH 无水乙醇中 G!" k保存备用 亲鱼培育水温为自 然海水水温仔鱼培育水温为 #' i!" k
表 !"许氏平 ' 组微卫星多重 U(T特征
D2B#!"D7.@72-2@0.-8108@15:' E8@-5120.>>80.E,>08;>.J P+G18/!"#$%&"%%'()"*")++
多重 U(T体系 Q245*V4,_7,5
核心序列
位点
登录号
(;/,
N;S2- K,+P3+[ =;9
收稿日期!!"#$ G"A G"$)接收日期!!"#$ G"F G## 资助项目!山东省自然科学基金& jT!"#C(U!#' ) 现代农业产业技术体系专项& (JT7 G'% Gj#'' ) 山东省重点研发计划项目
&!"#%Kgf#F#"%' ) 山东省农业重大应用技术创新项目&!"#% G!"!"' 第一作者!韩慧宗&#B$C G' "男"硕士"助理研究员"研究方向为鱼类遗传育种")3+)2*^;+M%!Bb#CA9S;\ 通信作者!姜海滨"研究员"研究方向为水产养殖及鱼类遗传育种")3*X*+E*3+MA!Cb#CA9S;\
的构建U(T体系引物的位点组合重复单元碱基 图谱目的条带清晰且不重合染色均匀准确性较
& F"
中国渔业质量与标准
!"#$ 年

高 结果表明实验构建的微卫星 F 组多重 U(T可 用于交配后代的亲权鉴定分析和亲本贡献率研究
!#$"实验方法
!#%"数据统计分析
使用 (cT:O7 A9" 软件对 ' 个母本' 个 家 系 每个家系选取 B' 个子代 及 #" 个候选父本进行亲 权鉴定 具体参数设置为母本已知候选父本为 #" 个模 拟 子 代 数 为 #" """ 置 信 区 间 设 置 为 BFH #""H的亲本检测率#H的分型误差率#""H的位点 检测率 统计等位基因数 ;3 观测杂合度 <; 期 望杂合度 <, 多态信息含量 BK" 无效等位基因 频率 MG;055 双亲基因型已知的非亲排除率 NB
-,]2,+S,
引物序列 U/*\,/-,]2,+S,FtGAt
引物浓度 D 片段大小 退火温度
\;4NG#
DXV
Dk
(;+S,+5/35*;+ 7*^,
=$
Q245*V4,_7,5# g8# GC
hQ"%B!%C
序列产物大小退火温度如表 # 所示 #9!9A&U(T反应及产物检测
点对许氏平群体遗传分析遗传图谱构建等研 究已得到应用 #' G#F 但目 前 尚 未 有 关 于 许 氏 平
U(T反应体系为 !F N包含 #%9$ N66g! ? !9F N#" mU(TP2RR,/ QM! n "9F N#" \\;4DN
多重 U(T体系的构建及应用的报道 本研究利用 本课题组开发的 #A 对高多态性微卫星标记进行
6=aU-正 反 引 物 各 # N # O a3] 酶 ! N模 板 >=J 反应程序为B' k 预变性 F \*+B' k 变性
优化组合建立 了 许 氏 平 A 个 三 重 U(T和 ! 个 '" -退火 '" -%! k延伸 # \*+AF 个循环%! k延
#9!9#&基因组 >=J的提取 采用传统的饱和酚 G氯仿 G异戊醇法#' 进行实
和累积排除率 "NB 等 确定亲缘关系后统计所 用标 记 下 的 亲 子 鉴 定 准 确 的 比 率 计 算 方 法 为 3
验样品的基因组 >=J提取 提取完成后用 "9$H的 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性通过分光光度计测定 >=J 浓 度 和 纯 度 将 >=J 质 量 浓 度 稀 释 至
两重 U(T反应体 系 对 雌 雄 交 尾 成 功 的 ' 个 母 本 伸 #" \*+' k下保存 U(T产物用 $H非变形聚丙
和所产家系及 #" 个候 选 父 本 进 行 亲 权 鉴 定在 检 烯酰胺凝胶电泳检测用 #" XV >=J4366,/标记等位
ห้องสมุดไป่ตู้
测许氏平 亲 子 鉴 定 准 确 率 的 同 时 分 析 其 交 配 基因位置使用银染染色法染色用 P*;GF""" U2-扫
许氏平交配行为一般发生在晚上"不易观察" 初冠囡等%F( 通过对雌亲家系后代研究发现许氏平 存在*一雌多雄+的受精方式"而 *一雄多雌+ 的受精 方式目前仍没有定论# 同时"单条许氏平成熟雌鱼 产仔量在 #" 万尾以上"有限数量亲本就可以繁殖大 量的后代群体"而参与交配的繁殖亲本对后代贡献的 大小直接影响人工选育和放流群体遗传多样性%C( # 72M3\3等%%( 对真鲷& B$1#0%8$L&#' 亲本对子代贡献 率分析中也发现"只有不到 A"H的亲本对后代基因 库有贡献# 陈睿毅等%$( 用 $ 雄 F 雌牙鲆亲鱼配组"结 果亲本贡献率最高达到 '%9A'H"最低仅为 "9FAH# 亲本对子代贡献率不均衡通过累代繁殖"可能造成群 体的遗传多样性降低#
在水产动 物 研 究 领 域" 微 卫 星 多 重 U(T技 术 因具有省时高效$低成本$高通量等优点"能够降 低分型过程重复带来的人工误差%B( "已广泛应用 于水产动 物 亲 子 鉴 定 中" 如 大 菱 鲆 & ,-&*.'.$580% 8$A280%' %#"( $ 凡 纳 滨 对 虾 & F2'&*(!$(0% +$!E
&& 许 氏 平 & ,(/$%'(%%-.5(1(522' " 隶 属 于 形 目 & 7S;/V3,+*R;/\,-' $?科 & 7S;/V3,+*63,' $ 平 属 & ,(E /$%'(%' "俗称黑?"是中国黄$渤海区常见的近海冷温 性底层岩礁经济鱼类# 由于其肉质鲜美细腻"营养丰 富"赢得了北方地区*黑石斑+ 的美誉"深受国内外市 场欢迎# 同时具有洄游范围小$抗病力强$生长速度 快$可自然越冬等特点"已成为中国北方沿海网箱养 殖$增殖放流$休闲垂钓和海洋牧场的重要鱼种# 许 氏平属于卵胎生鱼类"性成熟的雌雄亲鱼常在每年 ## 月左右交尾"交尾后精子以* 精囊+ 的形式储存在 雌鱼卵巢内"分布于输卵管$卵巢膜以下等位置%#( " 至翌年的 ' 月中旬开始受精"胚胎在雌鱼体内发育" 出膜后 继 续 发 育" 至 F 月 左 右 产 出 自 由 活 动 的 仔 鱼%!( # 近二十年来"随着自然采捕捞量的增加"许氏 平野生资源显著减少"北方沿海开展了人工增殖放 流工作%A G'( # 由于市场消费和优良苗种需求量巨大" 本课题组从 !""C 年开始陆续开展了许氏平良种选 育工作#
海生工生物工程有限公司合成 以扩增效率高多态
本研究利用 #A 对微卫星构建了 A 个三重 U(T
性高杂带较少目的条带清晰且不相重合为基本原 和 ! 个二重 U(T体系 图 # 示体系 Q245*V4,_7,5' 和
则挑选最优的 #A 对微卫星引物用于多重 U(T体系 Q245*V4,_7,5! 在部分子代中的聚丙烯酰胺凝胶电泳
!#!"实验材料
合同时选择扩增片段不重叠退火温度相近 温差
于 !"#C 年 #" 月在烟台泰华海洋科技有限公司 不超过 F k 引物序列不出现错配和引物二聚体的
选取健康并达到性成熟且性腺发育良好的雌雄亲鱼 微卫星位点进行两重 U(T构建 在此基础上加入
各 #" 尾放养于工厂化室内养殖池内通过控温控光 第 A 个引物筛选构建三重 U(T体系 通过对引物
许氏平微卫星多重 P+G体系构建及亲本对子代贡献率
韩慧宗# 刘阳#! 王腾腾# 张明亮# 王斐# 孙娜#! 姜海滨#
#9山东省海洋资源与环境研究院 山东省海洋生态修复重点实验室 山东 烟台 !C'""C !9上海海洋大学水产与生命学院 上海 !"#A"C
摘要!为了探究许氏平& ,(/$%'(%%-.5(1(522' 交配模式和父本对子代的贡献率"利用本课题组开发的 #A 对许氏平高 多态性微卫星标记"基于扩增片段大小$退火温度$引物浓度等条件进行优化组合"成功构建了 A 个三重和 ! 个两重 U(T反应体系# 同时设计 #" 雌与 #" 雄许氏平亲鱼自由交尾实验"有 ' 尾雌鱼顺利产仔"运用 (cT:O7 A9" 软件对 ' 个母本$' 个家系& 每个家系取 B' 个个体' 及 #" 个候选父本进行亲权鉴定# 结果表明!在双亲基因型已知的情况下" 当利用 F 组多重 U(T反应体系鉴定 ' 个家系时"累积排除率均达到 "9BBB BBB 以上"亲子鉴定准确率均达到 #""H"可 有效鉴定许氏平 ' 个家系的亲权关系)能鉴定到父本数为 A iC 个"' 个家系中父本数依次为 C$F$' 和 A 个"雄性亲 鱼 Q3! 和 Q3% 参与到 ' 个母本交配受精中"Q3A$Q3'$Q3F 和 Q3#" 则参与到 ! 个母本交配受精"因此"说明 * 一雌多 雄+ 和* 一雄多雌+ 的交配模式均存在# 在所有子代中"父本对子代的贡献差异很大"贡献率最高的为 Q3%$Q3! 和 Q3C"其总和达到 C%9$!H# 其中 Q3# 和 Q3B 未发现子代"说明未参与交配或交配受精不成功"其贡献率为 "# 本研究 可为许氏平人工繁育和良种选育提供科学理论依据# % 中国渔业质量与标准"!"#$"$&'' !'$ GF%( 关键词!许氏平)微卫星标记)多重 U(T体系)亲子鉴定)交配模式)贡献率 中图分类号!7B#%9'&&&文献标志码!J&&&文章编号!!"BF G#$AA&!"#$'"' G""'$ G#"
H d O#"" 式中 6为成功鉴定出父母本的子
代个体数>为取样子代数
F" +MDN G!" k保存备用 #9!9!&微卫星候选标记的筛选
$"实验结果
从本课题组已开发的多态性较高且扩增效果较 好的微卫星引物中挑选 !F 对'#' 微卫星引物由上
$#!"许氏平微卫星多重 P+G体系的建立
!"#$ 年 % 月
中国渔业质量与标准
8249!"#$
第 $ 卷&第 ' 期
()*+,-,.*-),/01234*503+6 753+63/6-
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>?@!#"9ABCB DE9*--+9!"BF G#$AA9!"#$9"'9""C
模式计算不同父本对子 代 的 贡 献 率旨 在 为 许 氏 描仪扫描电泳图谱扩增产物目的片段大小由 K,4G
平良种育种和苗种繁育提供理论参考
U/;3+340^,/A! 凝胶分析软件定量
!"材料与方法
#9!9'&微卫星多重 U(T优化组合 根据各个微卫星位点的退火温度和 U(T扩增片
段大小差异性优先利用两个微卫星位点的两两组