卵巢癌细胞株SKOV3在人脐带间充质干细胞培养液中的增殖、凋亡和迁移情况观察
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山东医药２０１８ 年第５８ 卷第１１ 期
Байду номын сангаас
培卵养巢液癌中细的胞增株殖ＳＫ、Ｏ凋Ｖ亡３ 在和人迁脐移带情间况充观质察干细胞
袁晓凤１，袁修凯２，周芳１ （１ 中国人民解放军第９７ 医院，江苏徐州２２１０００；２ 睢宁中医院）
摘要：目的 探讨卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ３ 细胞在人脐带间充质干细胞（ｈＵＣＭＳＣｓ）培养液中的增殖、凋亡和迁
的增殖、凋亡和迁移情况。现报告如下。
化后收集细胞备用。将ｈＵＣＭＳＣｓ 细胞以５ × １０５
１ 材料与方法
个细胞密度，接种于培养瓶中，待细胞融合度达到
材料低糖 和高糖 购自 １． １
ＤＭＥＭ
ＤＭＥＭ
Ｇｉｂｃｏ
８０％ 时，更换无血清的ＬＤＭＥＭ 培养液，２４ ｈ 后提
公司；血清购自Ｅｘｃｅｌｌ 公司；小鼠抗大鼠ＧＡＰＤＨ 单 克隆抗体（ｍＡｂ）、小鼠抗大鼠Ｂｃｌ２ ｍＡｂ 和小鼠抗
察２ 组和对照组。观察１、２ 组分别用１０％ 、２０％ 的 ｈＵＣＭＳＣ 培养，对照组用正常培养基培养。 １． ４ 各组ＳＫＯＶ３ 细胞增殖情况观察 ①ＭＴＴ 法。 取对数期生长的ＳＫＯＶ３ 接种于９６ 孔板，每孔２ ０００ 个细胞，然后每孔加入２００ μＬ ＨＤＭＥＭ 营养液，
通信作者：周芳（ ： ） Ｅｍａｉｌ ｚｈｏｕｆａｎｇ９７＠ １６３． ｃｏｍ
溶液，避光振荡 ，酶标仪检测 用 法。用 、 的 μＬ ＤＭＳＯ
１５ ｍｉｎ
４９０
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
１０％ ２０％ ｈＵＣＭＳＣｓ
ｎｍ 处的吸光度值。每个观察组设４ 个复孔。以未 培养液预处理ＳＫＯＶ３ 细胞２４ ｈ，分别计为观察１
经ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液处理的ＳＫＯＶ３ 细胞作为对照 组、观察２ 组。以未经ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液处理的ＳＫ
组。实验重复３ 次。②细胞平板克隆实验。取对数 ＯＶ３ 细胞为对照组。收集各组ＳＫＯＶ３ 细胞在ＲＩＰＡ
期生长的ＳＫＯＶ３ 细胞按５００ ／ 孔接种于小皿中，用 缓冲液中裂解并收集蛋白，用１２％ ＳＤＳＰＡＧＥ 电泳
ＨＤＭＥＭ 营养液培养过夜后，换１０％ 、２０％ 的ｈＵＣ 分离（最佳分离范围１２ ～ ６０ ｋＤ），随后电转移到
： （ ） 中图分类号： 文献标志码： 文章编号
Ｒ７３７． ３１
Ａ
１００２２６６Ｘ ２０１８ １１００４６０４
脐带间充质干细胞（ｈＵＣＭＳＣｓ）是一类具有自 公司。 Ｔｈｅｒｍｏ
我更新和多向分化潜能的多能干细胞［１，２］。ｈＵＣ
的分离、培养及 细胞培 １． ２ ｈＵＣＭＳＣｓ
、 ３７ ℃ ５％
ｈＵＣＭＳＣｓ
Ｃ培Ｏ养２ 培液（养分过别夜计后为，观次察日１换组１、０观％ 、察２０２％组的）
４６
山东医药２０１８ 年第５８ 卷第１１ 期
继孵续 育培箱养培养２４ ４ｈ，ｈ每后孔弃加掉入上２０清μ培Ｌ养ＭＴ基Ｔ，，３每７孔℃加、５入％ Ｃ１Ｏ５０２
随机选取视野拍照，计数每个视野下的细胞数。 １． ７ 各组ＳＫＯＶ３ 细胞Ｂｃｌ２ 和Ｂａｘ 蛋白检测 采
和肿瘤之间具有密切的联系［５，６］，卵巢癌是妇产科 后去掉脐带组织中的动脉和静脉，将脐带组织剪成
最常见的恶性肿瘤之一，由于该肿瘤起病比较隐匿， 约１ ｍｍ３ 的小块，小心均匀的贴在１０ ｍｍ × ３５ ｍｍ
缺乏特异表现，在临床上确诊时大多已经晚期，是女 小皿中并加入含有双抗的ＬＤＭＥＭ 培养液，放在
ｈＵＣＭＳＣｓ
ＭＳＣｓ 取材方便，易于分离培养，低免疫原性低，且遗 养液的制备 在超净工作台中无菌操作，用ＰＢＳ 冲
传性状稳定［３，４］，故被认为是组织工程的理想种子 洗掉脐带表明残留的血液，在含双抗（青／ 链霉素，
细胞。越来越多的研究发现，间充质干细胞（ＭＳＣｓ） 终浓度为１００ Ｕ／ ｍＬ）的营养液中浸泡约１５ ｍｉｎ，随
取培养液，０． ２２ μｍ 滤膜过滤。 －２０ ℃保存备用。 １． ３ ＳＫＯＶ３ 细胞分组及ｈＵＣＭＳＣ 细胞培养液应
大鼠Ｂａｘ ｍＡｂ 购自Ｉｍｍｕｗａｙ 公司；ＭＴＴ 四甲基偶氮 用 将体外培养的ＳＫＯＶ３ 细胞分为观察１ 组、观
唑蓝试剂购自碧云天生物技术公司；成骨、成脂诱导 液以及碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和油红Ｏ 染色液购自广 州赛业公司；凋亡试剂盒购自Ｓｉｇｍａ 公司；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ 小室、６ 孔板、２５ ｃｍ２ 细胞培养瓶购自Ｃｏｒｎｉｎｇ 公司； 倒置显微镜购自Ｎｉｋｏｎ 公司；二氧化碳孵育箱购自
性生殖系统肿瘤中病死率最高的肿瘤。本研究以卵 巢癌细胞株ＳＫＯＶ３ 为研究对象，观察了卵巢癌细胞
３７７～℃１０、５ｄ％可Ｃ见Ｏ２纤孵维箱样内的培细养胞，每从３脐ｄ带换组液织１块次中。爬培出养，
株 在 培养液 培养液中 ＳＫＯＶ３ ｈＵＣＭＳＣｓ
ｈＵＣＭＳＣｓ
待细胞融合到８０％ 时消化传代。经过３ 次传代纯
组小于观察１ 组（Ｐ 均＜０． ０５）。结论 ＳＫＯＶ３ 细胞在ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液中细胞增殖和迁移能力增强、细胞凋亡受
到抑制，Ｂｃｌ２ 蛋白表达增强，Ｂａｘ 蛋白表达降低。
关键词：脐带间充质干细胞；卵巢癌；细胞增殖；细胞凋亡；细胞迁移
： ｄｏｉ １０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００２２６６Ｘ． ２０１８． １１． ０１３
移情况。方法 从人脐带组织中分离、纯化ｈＵＣＭＳＣｓ，收集第３ 代ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液。将体外培养的ＳＫＯＶ３ 细胞
分为观察１ 组、观察２ 组和对照组。观察１、２ 组分别用１０％ 、２０％ 的ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液培养２４ ｈ，对照组用正常培
养基培养２４ ｈ。采用ＭＴＴ 法和平板克隆实验观察各组细胞增殖情况，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，采用
划痕实验和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ 实验观察各组细胞迁移能力，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 法检测各组细胞Ｂａｘ、Ｂｃｌ２ 蛋白。结果
观察１、２ 组吸光度值、细胞克隆数、划痕愈合率、穿膜细胞数、Ｂｃｌ２ 相对表达量均大于对照组（Ｐ 均＜０． ０５），且观察
２ 组大于观察１ 组（Ｐ 均＜０． ０５）；观察１、２ 组细胞凋亡率和Ｂａｘ 相对表达量均小于对照组（Ｐ 均＜ ０． ０５），且观察２
Байду номын сангаас
培卵养巢液癌中细的胞增株殖ＳＫ、Ｏ凋Ｖ亡３ 在和人迁脐移带情间况充观质察干细胞
袁晓凤１，袁修凯２，周芳１ （１ 中国人民解放军第９７ 医院，江苏徐州２２１０００；２ 睢宁中医院）
摘要：目的 探讨卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ３ 细胞在人脐带间充质干细胞（ｈＵＣＭＳＣｓ）培养液中的增殖、凋亡和迁
的增殖、凋亡和迁移情况。现报告如下。
化后收集细胞备用。将ｈＵＣＭＳＣｓ 细胞以５ × １０５
１ 材料与方法
个细胞密度，接种于培养瓶中，待细胞融合度达到
材料低糖 和高糖 购自 １． １
ＤＭＥＭ
ＤＭＥＭ
Ｇｉｂｃｏ
８０％ 时，更换无血清的ＬＤＭＥＭ 培养液，２４ ｈ 后提
公司；血清购自Ｅｘｃｅｌｌ 公司；小鼠抗大鼠ＧＡＰＤＨ 单 克隆抗体（ｍＡｂ）、小鼠抗大鼠Ｂｃｌ２ ｍＡｂ 和小鼠抗
察２ 组和对照组。观察１、２ 组分别用１０％ 、２０％ 的 ｈＵＣＭＳＣ 培养，对照组用正常培养基培养。 １． ４ 各组ＳＫＯＶ３ 细胞增殖情况观察 ①ＭＴＴ 法。 取对数期生长的ＳＫＯＶ３ 接种于９６ 孔板，每孔２ ０００ 个细胞，然后每孔加入２００ μＬ ＨＤＭＥＭ 营养液，
通信作者：周芳（ ： ） Ｅｍａｉｌ ｚｈｏｕｆａｎｇ９７＠ １６３． ｃｏｍ
溶液，避光振荡 ，酶标仪检测 用 法。用 、 的 μＬ ＤＭＳＯ
１５ ｍｉｎ
４９０
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
１０％ ２０％ ｈＵＣＭＳＣｓ
ｎｍ 处的吸光度值。每个观察组设４ 个复孔。以未 培养液预处理ＳＫＯＶ３ 细胞２４ ｈ，分别计为观察１
经ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液处理的ＳＫＯＶ３ 细胞作为对照 组、观察２ 组。以未经ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液处理的ＳＫ
组。实验重复３ 次。②细胞平板克隆实验。取对数 ＯＶ３ 细胞为对照组。收集各组ＳＫＯＶ３ 细胞在ＲＩＰＡ
期生长的ＳＫＯＶ３ 细胞按５００ ／ 孔接种于小皿中，用 缓冲液中裂解并收集蛋白，用１２％ ＳＤＳＰＡＧＥ 电泳
ＨＤＭＥＭ 营养液培养过夜后，换１０％ 、２０％ 的ｈＵＣ 分离（最佳分离范围１２ ～ ６０ ｋＤ），随后电转移到
： （ ） 中图分类号： 文献标志码： 文章编号
Ｒ７３７． ３１
Ａ
１００２２６６Ｘ ２０１８ １１００４６０４
脐带间充质干细胞（ｈＵＣＭＳＣｓ）是一类具有自 公司。 Ｔｈｅｒｍｏ
我更新和多向分化潜能的多能干细胞［１，２］。ｈＵＣ
的分离、培养及 细胞培 １． ２ ｈＵＣＭＳＣｓ
、 ３７ ℃ ５％
ｈＵＣＭＳＣｓ
Ｃ培Ｏ养２ 培液（养分过别夜计后为，观次察日１换组１、０观％ 、察２０２％组的）
４６
山东医药２０１８ 年第５８ 卷第１１ 期
继孵续 育培箱养培养２４ ４ｈ，ｈ每后孔弃加掉入上２０清μ培Ｌ养ＭＴ基Ｔ，，３每７孔℃加、５入％ Ｃ１Ｏ５０２
随机选取视野拍照，计数每个视野下的细胞数。 １． ７ 各组ＳＫＯＶ３ 细胞Ｂｃｌ２ 和Ｂａｘ 蛋白检测 采
和肿瘤之间具有密切的联系［５，６］，卵巢癌是妇产科 后去掉脐带组织中的动脉和静脉，将脐带组织剪成
最常见的恶性肿瘤之一，由于该肿瘤起病比较隐匿， 约１ ｍｍ３ 的小块，小心均匀的贴在１０ ｍｍ × ３５ ｍｍ
缺乏特异表现，在临床上确诊时大多已经晚期，是女 小皿中并加入含有双抗的ＬＤＭＥＭ 培养液，放在
ｈＵＣＭＳＣｓ
ＭＳＣｓ 取材方便，易于分离培养，低免疫原性低，且遗 养液的制备 在超净工作台中无菌操作，用ＰＢＳ 冲
传性状稳定［３，４］，故被认为是组织工程的理想种子 洗掉脐带表明残留的血液，在含双抗（青／ 链霉素，
细胞。越来越多的研究发现，间充质干细胞（ＭＳＣｓ） 终浓度为１００ Ｕ／ ｍＬ）的营养液中浸泡约１５ ｍｉｎ，随
取培养液，０． ２２ μｍ 滤膜过滤。 －２０ ℃保存备用。 １． ３ ＳＫＯＶ３ 细胞分组及ｈＵＣＭＳＣ 细胞培养液应
大鼠Ｂａｘ ｍＡｂ 购自Ｉｍｍｕｗａｙ 公司；ＭＴＴ 四甲基偶氮 用 将体外培养的ＳＫＯＶ３ 细胞分为观察１ 组、观
唑蓝试剂购自碧云天生物技术公司；成骨、成脂诱导 液以及碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和油红Ｏ 染色液购自广 州赛业公司；凋亡试剂盒购自Ｓｉｇｍａ 公司；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ 小室、６ 孔板、２５ ｃｍ２ 细胞培养瓶购自Ｃｏｒｎｉｎｇ 公司； 倒置显微镜购自Ｎｉｋｏｎ 公司；二氧化碳孵育箱购自
性生殖系统肿瘤中病死率最高的肿瘤。本研究以卵 巢癌细胞株ＳＫＯＶ３ 为研究对象，观察了卵巢癌细胞
３７７～℃１０、５ｄ％可Ｃ见Ｏ２纤孵维箱样内的培细养胞，每从３脐ｄ带换组液织１块次中。爬培出养，
株 在 培养液 培养液中 ＳＫＯＶ３ ｈＵＣＭＳＣｓ
ｈＵＣＭＳＣｓ
待细胞融合到８０％ 时消化传代。经过３ 次传代纯
组小于观察１ 组（Ｐ 均＜０． ０５）。结论 ＳＫＯＶ３ 细胞在ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液中细胞增殖和迁移能力增强、细胞凋亡受
到抑制，Ｂｃｌ２ 蛋白表达增强，Ｂａｘ 蛋白表达降低。
关键词：脐带间充质干细胞；卵巢癌；细胞增殖；细胞凋亡；细胞迁移
： ｄｏｉ １０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００２２６６Ｘ． ２０１８． １１． ０１３
移情况。方法 从人脐带组织中分离、纯化ｈＵＣＭＳＣｓ，收集第３ 代ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液。将体外培养的ＳＫＯＶ３ 细胞
分为观察１ 组、观察２ 组和对照组。观察１、２ 组分别用１０％ 、２０％ 的ｈＵＣＭＳＣｓ 培养液培养２４ ｈ，对照组用正常培
养基培养２４ ｈ。采用ＭＴＴ 法和平板克隆实验观察各组细胞增殖情况，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，采用
划痕实验和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ 实验观察各组细胞迁移能力，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 法检测各组细胞Ｂａｘ、Ｂｃｌ２ 蛋白。结果
观察１、２ 组吸光度值、细胞克隆数、划痕愈合率、穿膜细胞数、Ｂｃｌ２ 相对表达量均大于对照组（Ｐ 均＜０． ０５），且观察
２ 组大于观察１ 组（Ｐ 均＜０． ０５）；观察１、２ 组细胞凋亡率和Ｂａｘ 相对表达量均小于对照组（Ｐ 均＜ ０． ０５），且观察２